[发明专利]用于生产γ－环糊精的环糊精糖基转移酶

说明书

本发明涉及用于生产γ-环糊精的环糊精糖基转移酶(CGTase)EC2.4.1.19，并涉及γ-环糊精糖基转移酶的制备方法及应用。

通常情况下，环糊精是由淀粉或淀粉样底物制备而得的。在这种制备过程中，CGTase被用作为催化剂，将淀粉转化为环糊精(CD)。当反应进行到热动力学平衡状态时(CD产量最大)，由于热动力学的原因，不论反应中用的CGTase为何种类型，淀粉都将主要被转化为β-CD。然而在起始阶段，即淀粉转化反应刚刚开始时，使用不同类型的转移酶会使初级阶段产物混合物在组成上有所不同。依据此起始阶段中所产生的CD主要是α-，β-，还是γ-类型的，分别将对应的CGTase划分成α-，β-，和γ-类型。

这些酶适用于、并已经用于CD的工业化生产。迄今为止，只在细菌中检测到有这些酶的存在。到目前为止，α-CGTase仅在软化芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、和Klebsiellaoxytoca中得到鉴定。在环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Bacillus ohbensis、微球菌、以及未精确分类的嗜碱性芽孢杆菌如：芽孢杆菌38-2，17-1，1011或1-1中，都已检测到β-CGTase。有报道说，在枯草芽孢杆菌313，芽孢杆菌A1-6和芽孢杆菌290-3中具有能在初始阶段催化γ-CD形成的高活性的天然转移酶。

由于环糊精的工业化生产过程中所用的CGTase总是将淀粉转化成多种环糊精的混合物，因而，人们发展出了各种方法以分离纯化环糊精(α-、β-或γ-型的)。这些方法描述如下：

通过色谱法，例如根据其分子量的差异(US-A-4,808,232)可从反应产物混合物中分离出特定的CD来。

通常，在将淀粉以酶学方法转化成环糊精时，可在反应体系中加入只与某一特定的CD发生反应的配位剂，从而使该种CD形成不溶性的配合物。然后，可以用物理学的方法，从反应混合物体系中将其分离出来。接着再将该配合物溶解以纯化出均一的CD(参见EP0291067)。

如果采用的是γ-CGTase，在反应混合物体系中加入有机溶剂，如乙醇，可使产物的组成向γ-CD的方向转移。(参见J.Ferm.Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)

如果要制备某一种类型的纯化CD，则在生产的每一个过程中部应对所使用的CGTase进行最优化选择，以使所形成的初始产物中该类型的CD尽可能地多。

关于α-和β-CGTase特异性的现有知识已足以进行相应的环糊精的工业化生产。相比而言，没有一个已知的天然γ-CGTase的产物特异性能允许进行相应规模的γ-CD的工业化生产。

因此，要制备γ-CD，建议参照CA115：157165，通过添加γ-CD特异性的配位剂糖基化甘草甜，麦芽糖和一种CGTase，可将α-和/或β-环糊精酶促转化为γ-CD。

制备γ-CD的另一种选择方案是通过对β-CGTase的特定氨基酸残基进行置换以增强它的γ-CD特异性，从而使该突变后的转移酶所产生的γ-CD比例增加，以便能够进行工业化规模的γ-CD的生产。已知可行的诱变方案参见DE43 24 650 A1(相应于US-A-5,474,917)，Biochemistry(1994)33(33)，pp.9929-9936，Biochemistry(1995)34(10)，pp.3368-3376，和J.Biotech.(1994)32，pp.283-288。

通过对β-CGTase进行诱变所获得的这种CGTase衍生物对γ-CD的特异性增加，依据其产物类型分布的情况，理论上是适用于进行γ-CD的工业化生产的。但它的一个不足之处是引入相应的突变之后，会使酶的比活下降。根据所引入的氨基酸残基的不同，诱变后的酶对γ-CD的特异性虽然都提高了，但催化CD生成的活性只有原型转移酶的25％到59％(Biochemistry(1994)33(33)，pp.9929-9936，Biochemistry(1995)34(10)，pp.3368-3376)。

本发明的目的在于提供这样的环糊精糖基转移酶(CGTase)，其在将淀粉或淀粉样底物转化为CD时，能形成更高比例的γ-CD，并且其比活不低于原型转移酶的60％。

本发明的另一个目的在于提供制备所述CGTase的方法。

本发明的再一个目的在于提供生产γ-CD的方法。