[发明专利]制备单体卡利许霉素衍生物/载体的共轭物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种制备单体卡利许霉素衍生物/载体的共轭物的方法。

发明背景

自从1970年代公开了发现制备单克隆抗体的方法(G.Kohler和C.Milstein；自然，256：495(1975))以来，人们曾作了许多尝试用这些蛋白质选择性地定向结合目标抗肿瘤试剂来抗肿瘤。(如见，T.Ghose和A.H.Blair，CRC关键Rev.药物载体系统(CRC Critical Rev.Drug Carrier Systems)，3：263，1987，G.A.Koppel，生物共轭化学(Bioconjugate Chem.1：13，1990和J.Upeslacis和L.Hinman，Ann.Rep.Med.Chem.23：151，1988)。尽管该领域仍有进展，但是许多经典的抗肿瘤试剂由于多种原因而产生了效率相当低的抗体共轭物。低效率的一个原因是缺少化学治疗的效力。

有效的抗菌和抗肿瘤试剂类被称为卡利许霉素或LL-E33288混合物，在美国专利No.4,970,188(1990)中有所描述。最有效的试剂是命名为γ₁¹，这里只简单参照为γ。这些化合物含有一个甲基三硫化物，它可与合适的硫醇反应形成二硫键，同时加入一个有用于使卡利许霉素衍生物与载体连接的官能团如酰肼或其它官能团。这些与卡利许霉素反应的例子在美国专利No.5,053,394中有所描述，其中也公开了卡利许霉素的定向(靶向)形式。

限制上述共轭物的用途的因素是当可与载体共轭连接的卡利许霉素衍生物的量(即药物负荷量)增加时，它们易形成凝聚体。理想的是在载体上应有尽可能多的药物负荷，且其同时应保持对载体蛋白的亲和性，因为较高的药物负荷可提高共轭物的固有的效率。凝聚体必须在治疗过程中被除去，凝聚体的存在也将使这些共轭物的规模放大制备更困难，并降低产物的得率。因此，卡利许霉素在载体蛋白上的负荷量(药物负荷量)，在共轭反应中形成的凝聚体的量，以及最终可获得的纯化的单体共轭物的得率均有关联。因此，在较高的药物负荷量和最终单体的得率间必须通过调节加入共轭反应的起反应的卡利许霉素衍生物的量来进行折衷。

用欧洲专利No.0689845中描述的连接剂进行共轭反应时卡利许霉素共轭物有凝集趋势特别成问题。在这种情况下，生成的共轭物很大部分是以凝集的形式存在难以进行纯化以用于治疗给药。对于一些载体蛋白来说，除非小规模制备否则甚至不可能制成适中负荷的共轭物，因此，非常有必要有一种使胞毒药物如卡利许霉素与载体共轭结合以减少凝集量从而使药物负荷尽可能高且有合理的产物得率的方法。好的生物活性所需的实际药物负荷，在纯化过程中可完全除去的凝集量和最后可获得的共轭物的得率需要个别一一测定。

发明概要

本发明的卡利许霉素衍生物/载体共轭物有下列化学式

                           Pr(-X-S-S-W)_m

其中：

Pr为一种蛋白质载体，

X是一种连接剂，它包括任何可与蛋白质载体反应的反应基团的产物，

W是通过除去天然存在的甲基三硫化物基团后形成的卡利许霉素基团；和

m是0.5至15的数。

本发明含制备有较高药物负荷/得率和减少凝集的单体卡利许霉素衍生物/载体的方法包括步骤：

(1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，适当pH范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括(a)一个选自丙二醇，乙醇，DMSO，及其组合的一种助溶剂，和(b)一种至少包括一个C₆-C₁₈羧酸的添加剂，在约25℃至约37℃在其中培育约15分钟至约24小时；和

(2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。

本发明制备有较高药物负荷/得率和减少凝集的单体卡利许霉素衍生物/载体的另一种方法包括步骤：

(1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，适当pH范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括叔丁醇助溶剂，在其中培育在约25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和

(2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。

发明详细描述