[发明专利]测定体液中的蛋白片段

说明书

本发明涉及胶原或其它蛋白的降解产物的测定及为此而用到的材料。

胶原和胶原代谢性疾病

骨质疏松是人类最常见的骨病。原发性骨质疏松常伴有骨折发生率增高，这是由骨骼骨质的进行性减少引起的。据估计仅在美国就可影响一千五百一二千万人。它的基础是年龄依赖性的骨重建失衡，即骨组织的形成率和吸收率失衡。

在美国每年大约有一百二十万的老年人发生骨质疏松相关性骨折，其中包括大约538,000脊椎受压骨折，约227,000髋部骨折并且有相当多的早期四肢骨骨折。因为髋部骨折引起严重的损伤和出血，所以约有12-20％是致命的，一半的幸存者需要家庭护理。目前在美国每年对骨质疏松性损伤的总花费至少达100亿美元(Riggs，新英格兰医学杂志，327：620-627(1992))。

骨质疏松在绝经后的妇女中最常见，这些妇女在绝经后的10年中平均失去骨质的15％。这种疾病也可发生在老年男性和年轻的闭经的女运动员中。虽然骨质疏松带来重要的、增长着的社会和经济上后果，但是用于测定病人或健康人骨吸收率的方法非常有限。其它导致胶原代谢异常的(和与之相关的)疾病包括佩吉特氏病，马凡氏综合征，成骨不全，胶原组织中的肿瘤生长，侏儒症，类风湿性关节炎，骨关节炎和脉管炎综合征。

目前已经描述了三类人类胶原。已知I类胶原形成原纤维，它分为1型、II型、III型、V型和XI型。WO 95/08115的附录A中给出了I-III型氨基酸序列(就其已被阐明的范围)。

I型胶原占据骨有机基质的90％以上。因此，原则上可通过监测I型胶原的降解来估计骨吸收率。同样，包括结缔组织在内的一些其它疾病也可通过检测胶原的降解而进行监测。例如，II型胶原降解与类风湿性关节炎和骨关节炎相关，而III型胶原降解出现在脉管综合征中。

几组研究者已研究并测定了人类III型胶原、人类前α₁(II)胶原和人类III型胶原整个前原α₁(III)链的氨基酸序列及相应的cDNA克隆，参见Loil等，核酸研究12：9383-9394(1984)；Sangiorgi等，核酸研究，13：2207-2225(1985)；Baldwin等，生化杂志，262：521-528(1989)；Ala-Kokko等，生化杂志，260：509-516(1989)。

I型、II型和III型胶原均在有机体内以前胶原分子的形式存在，包括与核心胶原分子接合的N端和C端前肽序列。前肽被移去(这是在体内胶原合成的过程中自然发生的)后，剩余的核心胶原分子由大量末端端肽序列不是三股螺旋的三股螺旋区组成。这些端肽序列有重要功能，是胶原原纤维细胞外进行分子内交联的部位，α-螺旋区也包括交联部位。

分子内交联使胶原原纤维具有生物力学稳定性。这些交联的形成由赖氨酸和羟赖氨酸残基被修饰为相应的醛所启始。一些位于胶原相邻链上的残基能自然形成不同的分子内交联。交联部位在胶原端肽和螺旋区域的确切位置以前已有论述。例如，可参阅Kühn，K.，细胞外基质的免疫化学，1：1-29，CRC出版公司，Boca Raton，Florida，(1982)，Eyre，D.R.，生化综述年刊，53：717-48(1984)或美国专利No.5140103和5455179。并且，下面的表1中给出了I、II和III型胶原中形成交联的一些潜在部位的氨基酸序列。

纤维蛋白、胶原和弹性蛋白是基于由赖氨酸或赖氨酸侧链形成醛这一独特机制而交联的。I、II和III型胶原分子中的四个交联的同源位点很明显(参阅Kühn，K.，细胞外基质的免疫化学，1：1-29(1982))。两个为醛部位，每个端肽区域有一个。另外两个部位是对称分布于距每一分子末端90个残基的羟赖氨酸。当胶原分子组装成原纤维时，这些螺旋区域中最近的部位排列成直线并且与邻近分子中的端肽醛作用。有可靠证据证明3-羧羟基吡啶鎓残基是由羟赖氨酸而来的醛形成的成熟交联。然而，由其它途径形成的成熟交联残基，即由赖氨酸残基的醛形成而来的仍然不清楚。

由下面讨论的EP-0394296中的分子式进行的说明，已经发现两个3-羟基吡啶鎓交联是羟赖氨酸羟赖氨酰吡啶啉(亦简称作吡啶啉)和赖氨酰吡啶啉(亦称作“脱氧吡啶啉”)。这些交联化合物是天然荧光性的。如EP-A-0424428中论述的，发现一些羟赖氨酰吡啶啉交联是糖基化的。

然而，如Last等在国际生化杂志22(6)：559-564，1990中描述的，胶原中天然存在其它的交联。检测胶原降解的现有技术