[发明专利]哺乳动物细胞中的基因表达

说明书

本发明涉及哺乳动物细胞中的基因表达，特别是那些体内生物活性受包括特定糖基化的各种因素影响的蛋白质的基因。这类基因的例子有人β干扰素(IFNβ)、人促红细胞生成素(EPO)，人绒毛膜促性腺素、各种其它细胞因子和生长因子以及如Dengue病毒蛋白这种特定的病毒抗原，这些抗原的结构可关系到疫苗的开发。

在此之前，基因已经在哺乳动物细胞系中被大规模表达，特别是按Urlaub等人在美国国家科学院院刊77，4216-4220，1980中表明的方法在缺失二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的突变中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达。已使用过多种表达系统。因此在这些细胞中用于基因表达的多种载体是可得的。通常用于分离表达载体转化细胞的筛选方法基于使用氨甲蝶呤筛选dhfr和靶基因被共同扩增的转化株。

dhfr基因，能使细胞耐受氨甲蝶呤，常常与希望表达的基因一起被掺入载体中。然后在增加浓度的氨甲蝶呤条件下进行细胞筛选。这样因为有越多拷贝数目的细胞能耐受越高浓度的氨甲蝶呤，从而会导致细胞群的每个细胞中存在的dhfr基因数量扩增。随着dhfr基因被扩增，目的基因的拷贝数则伴随dhfr基因拷贝数而增加，由此使得目的基因表达增多。

遗憾的是，据报道在没有进行连续筛选时这些被扩增基因常常是不稳定的(Schimke，生物化学杂志263，5989-5992，1988)。这种不稳定性对现存的CHO dhfr细胞这一表达系统而言是固有的。

多年来，一直使用几个启动子驱动靶基因的表达，如SV40早期启动子、CMV早期启动子和SR_α启动子。据称CMV和SR_α启动子是最强的(Wenger等，分析生物化学221，416-418，1994)。

在一篇报道中，还使用β-干扰素启动子驱动β-干扰素基因在突变的CHO dhfr细胞中的表达(US-A-5376567)。但是在该系统中，必须通过Tan等人的方法(Tan等，美国国家科学院院刊67，464-471，1970；Tan等人，US-A-3773924)对所筛选的CHO dhfr细胞进行超诱导，以实现较高水平的β-干扰素的生产。在该系统中由CHO dhfr细胞生产的占显著百分量的超诱导β-干扰素没有被糖基化。

小鼠金属硫蛋白基因(mMT1)启动子也曾被用于CHO细胞、BHK和LTK^-小鼠细胞(Reiser等，1987，药物研究，37，4，482-485)中β-干扰素基因表达。但是使用这种启动子进行的β-干扰素表达不如用SV40早期启动子在CHO细胞中表达得那么好。并且，由mMT1启动子介导的这些细胞中β-干扰素的表达被重金属诱导。然而重金属对细胞极其有毒，因此放弃了使用该系统。取而代之的方法是，Reiser等人使用CHO dhfr表达系统与SV40早期启动子结合(Reiser等，药物研究，37，4，482-485(1987)和EP-A-0529300)以在由Urlaub等人的方法(1980)衍生的CHO dhfr细胞中生产β-干扰素。

我们现在已在野生型CHO细胞中表达了β-干扰素。使用一载体转染野生型CHO细胞，此载体包含一个在小鼠肉瘤病毒增强子和小鼠金属硫蛋白启动子(MSV-mMT1)控制下的β-干扰素基因、能驱动neo基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的启动子控制下的neo基因和一个具有其自身启动子的人金属硫蛋白基因。首先将细胞暴露于遗传霉素(抗菌素G418)中由此除去缺失neo基因的细胞，然后再将存活细胞暴露于浓度增大的重金属离子中，通过这种方法筛选出能表达β-干扰素的转染细胞。

重金属离子增强β-干扰素基因的MSV-mMT1启动子，由此增加β-干扰素的表达。重金属离子也诱导人金属硫蛋白基因启动子，导致人金属硫蛋白的表达。人金属硫蛋白保护细胞不受重金属离子的毒性影响。重金属离子的存在确保了对细胞的连续筛选，这些细胞含有被整合入其基因组的转染载体，或至少含有β-干扰素基因和人金属硫蛋白基因及其各自的启动子。

已被成功转染的筛选出的细胞表达β-干扰素。当细胞培养于Zn²⁺存在条件下时，表达水平惊人地提高。与原有的β-干扰素相比，这种β-干扰素具有改善的性质，特别是具有较高的生物利用度。

这些发现具有普遍的适用性。因此，本发明提供了

-一种核酸载体，包含：

(i)一个编码目的蛋白质的编码序列，它与一个能在重金属离子存在下指导该编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；