[发明专利]重组人糖基化尿激酶原的制备方法

说明书

本发明是利用生物工程技术，对以下六种载体如pUC19,pMM-UK,pSV₂-dhfr,pSV₂-pro-UK,pXMT,pMTSV-dhfr上的有用元件，经过重组，构建一个适合在中国仓鼠卵巢(CHO)母细胞中高效表达外源基因的新型载体(pMTSV-du)，然后将转染筛选获得的CHO工程细胞株CL-11G用微载体(Biosilon,SH-2,Cytopore)灌流培养技术和低血清培基进行高密度培养，并对产品进行四步或一步纯化，制备一种治疗冠状动脉梗塞，脑血栓，中央视网膜动静脉血栓及其他血栓病的药物-重组人尿激酶原(prourokinase,简称pro-UK)，此属于生物工程技术。

尿激酶原是尿激酶的前体，是一种糖蛋白，由411个氨基酸组成，其本身无活性，经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys¹⁵⁸-Ile¹⁵⁹之间的肽链打开形成尿激酶，才能发挥其溶血拴的效能。

自Bernit1973年发现pro-UK以来，已有人相继从人的血液，尿液和各种重组宿主细胞培养液中获得，如用大肠杆菌培养液中获得的有Holmes,W.E. 1985以及安内.布兰法兹等(中国专利，CN 1042181A,1990-05-16)，用酵母表达成功的如Melnick,L.M.等(1990)用中国仓鼠卵巢(CHO)母细胞表达成功的有Nells,L.等(1987)；Avgerinos,G.C.等(1990)。

本发明包括：1．人尿激酶原全长cDNA基因的克隆，2．构建在CHO细胞高效表达的转移载体和工程细胞株，3．对CHO工程细胞的大量培养，获得大量尿激酶原原料，并加以纯化，其目的在于利用生物工程技术制备一种适于临床应用的糖基化尿激酶原产品。

本发明的技术要点是：

1．通过对Detroit 562细胞的诱导和提取细胞总RNA，经反转录和dG·dC接尾构建了cDNA文库，再通过筛选和人工合成寡核苷酸等DNA重组技术，构建了尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19质粒DNA，获得pMM-UK重组质粒。

2．将几种表达载体如pUC19，pMM-UK，pSV₂-dhfr，pSV₂-proUK,pXMT,pMTSV-dhfr，等载体上的有用元件，经多次基因操作和重组，构建了一个适合在CHO细胞中高效表达外源基因的新型载体(pMTSV-du)。

3．采用微载体(Biosilon,SH-2,Cytopore)灌流培养技术和低血清培养基高密度培养CL-11G工程细胞，获得大量含高活性尿激酶原的原料。

4．采用四步法，即CM阳离子亲和层析-MPG吸附层析-Sephacryl S-200凝胶过滤-对氨基苯甲脒色谱，或采用一步法，即用抗体亲和层析法纯化产品。

实施例：

1．人尿激酶原全长cDNA基因的构建和克隆：采用肉豆寇酯(PMA)诱导Detroit 562细胞，使细胞内尿激酶mRNA含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA，oligo(dT)-纤维素柱层析法分离poly(A⁺)RNA,通过反转录和dG·dC接尾重组技术构建了Detroit 562细胞的cDNA文库，通过筛选获得了含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株。再采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重组技术，构建了人尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19质粒DNA，获得了pMM-UK重组质粒。全序列测定结果表明，cDNA基因全长为1565bp，含有60bp(20aa)信号肽序列，1233bp编码序列(1-411aa)和272bp 3'非编码序列。该基因5'端含有HindⅢ和EcoR 1单一酶切位点，3'端含有SalⅠ,XbaⅠ,SmaⅠ,KpnⅠ和SacⅠ 5个单一酶切位点，便于尿激原基因的克隆和表达。

2．中间载体1 pSV₂-pro-UK的构建：将pSV2-dhfr载体用BglⅡ酶切后用Klenow F酶补平，再用HindⅢ酶切，分离回收载体大片段；从pMM-UK质粒DNA中，用HindⅢ和SmaⅠ双酶切，分离pro-UK cDNA；将载体大片段与pro-UK cDNA连接形成可表达pro-UK的重组质粒pSV₂-pro-UK。