[发明专利]重组人糖基化尿激酶原的制备方法

权利要求书

1．一种重组人糖基化尿激酶原的制备方法，包括以下步骤：(1)人尿激酶原全长cDNA基因的构建和克隆，(2)表达载体的构建，(3)CHO工程细胞的转染和筛选，(4)CHO工程细胞的培养和(5)CHO工程细胞分泌产物的纯化，其特征在于CHO工程细胞是以CHO dhfr^-为宿主细胞，所述的表达载体是pMTSV-du，它由下图所示的各元件组成，并用微载体灌流培养技术高密度培养和放大培养CHO工程细胞。     

2．如权利要求1所述的一种重组人糖基化尿激酶原的制备方法，其特征在于：

(1)人尿激酶原全长cDNA基因的克隆，是采用肉豆寇酯诱导Detroit 562细胞，使细胞中尿激酶mRNA的含量提高8倍以上，用酸性硫氰胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA，oligo(dT)-纤维素柱层析法分离poly(A⁺)RNA，通过反转录和dG·dC接尾重组技术构建成Detroit 562细胞的cDNA文库，通过筛选而获得含有编码尿激酶基因片段的阳性克隆株，采用人工合成寡核苷酸片段和DNA重组技术，构建尿激酶原全长cDNA基因并克隆至pUC19质粒DNA，获得一个pMM-UK重组质粒，经全序列测定证明，cDNA核苷酸序列全长为1565bp，包括编码20个氨基酸信号肽的60bp序列，编码411氨基酸尿激酶原的1233bp序列和272bp3'非编码序列，该基因5'端含有HindⅢ和EcoR 1单一酶切位点，3'端含有SdlⅠ，XbaⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ和SacⅠ 5个单一酶切位点，便于尿激酶原的克隆和表达；

(2)中间载体pSV₂-pro-UK的构建，是将pSV2-dhfr载体用Bgl Ⅱ酶切后用Klenow F酶末端补平，再用HindⅢ酶切，分离回收载体大片段，从pMM-UK质粒DNA中，用HindⅢ和SmaⅠ双酶切，分离pro-UK cDNA，再将载体大片段与pro-UK cDNA连接形成可表达pro-UK的重组质粒pSV2-pro-UK；

(3)中间载体pMTSV-dhfr的构建，是将pSV2-dhfr表达质粒用BglⅡ酶切，并用Klenow F酶将末端补平，再通过T4 DNA连接酶将质粒重新环化，并消除质粒中的BglⅡ酶切位点，然后将该质粒经BamH 1和pVUⅡ双酶切及KlenowF酶将末端补平，通过电泳回收1.9Kb DNA片段，它含SV40增强子和二氢叶酸还原酶基因，将此片段插入经EcoR1酶切，klenowF酶末端补平的pXMT载体中，从而获得了长度为8.25Kb的中间载体pMTSV-dhfr；

(4)表达载体pMTSV-du的构建，将pSV2-pro-UK重组质粒经SalⅠ酶切，Klenow F酶末端补平，再通过T4 DNA连接酶将质粒重新环化并消除了质粒中的SalⅠ酶切位点，然后将该质粒经pVU1和EcoR Ⅴ双酶切及KlenowF酶将末端补平，通过电泳回收3.8Kb片段，它含全长尿激酶原cDNA，并将该片段插入经BglⅡ酶切，Klenow F酶末端补平的pMTSV-dhfr中间载体，从而获得一个长度为12Kb，能高效表达尿激酶原的载体pMTSV-du。

3．如权利要求1所述的一种重组人糖基化尿激酶原的制备方法，其特征在于转染和筛选高效表达的CHO工程细胞是将20-40微克表达载体pMTSV-du质粒DNA通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-dhfr^-细胞，先用HAT选择培养基筛选，10天后换成含1-3×10^-8MMTX选择培养基进行dhfr和MTX双重筛选，并对33株表达有尿激酶原活性的阳性转化细胞多次亚克隆和MTX加压扩增基因，再经锌离子诱导筛选出高效表达，活性达到500-800IU/10^-6细胞/天的尿激酶原工程细胞株。

4．如权利要求1所述的一种重组人糖基化尿激酶原的制备方法，其特征在于CHO工程细胞的高密度培养是用固体聚乙烯微载体Biosilon或SH-2和多孔纤维素微载体Cytopore在一个由灌流培养控制装置的反应器内进行灌流培养，灌流量逐渐增加，使细胞密度达1-2×10⁷/ml，尿激酶原的产量随细胞密度的增加而增加。