[发明专利]DNA碱基序列的测序方法及用于该方法的样品调制方法

说明书

本发明涉及利用由酶进行的DNA互补链合成的DNA分析方法、用于高效率的DNA碱基序列测序方法的样品的调制方法以及用于该方法的试剂盒。

随着对人基团组解析技术的进步，对高效率的DNA碱基序列的测序技术的要求提高了。使用放射性同位素标记DNA片段、通过凝胶电脉法测定DNA长度、再利用人工确定碱基序列的方法目前已被替代。将DNA用萤光物质标记，然后一边进行凝胶电泳一边进行光照，从而能够自动地光学检测DNA片段的测序仪(DNA Sequencers)已经得到普及。该装置使被称为引物(primer)的寡核苷酸与目的DNA进行杂交，制成用于使用酶的互补链合成来确定碱基序列的各种长度的DNA片段，利用凝胶电泳测定DNA片段的长度，然后再确定碱基序列的方法称为桑格(Sanger)(DNA测序)法或双脱氧(dideoxy)测序法。此处，能够一次确定碱基序列的长度，取决于利用凝胶的长度分离能力，为400-700碱基。比这更长的从数K个碱基至数十K个碱基的DNA碱基序列的测序要花费大量的时间和人力。

先前，在确定较长的DNA(数K-数十K碱基)的碱基序列时常用鸟枪(Shotgun)法。在鸟枪法中，利用超声波等将DNA样品随机地切断，将DNA片段克隆植入大肠菌等中培养，培养出菌落后，培养各菌落中的大肠菌，增加DNA的复制品。然后提取样品DAN进行解析。在该方法中，在取出的每个菌落中含有的DNA中含有片段化的样品DNA，但DNA片段究竟是样品DNA的哪个部分，这在确定碱基序列之前是不可能知道的，所以必须取相当于10-20倍的要确定DAN链长的DNA片段进行解析。因此要耗费大量的时间和人力，这成为很大的障碍。

确定DNA的碱基序列，是从制作DNA文库开始的，该文库收集有将含有基因的DNA形成的从10K碱基至100K碱基长度的克隆后全部的DNA。实际上在确定碱基序列时，将各克隆进一步切断，利用DNA测序仪制成可以用来分析的长度的亚克隆，然后进行碱基序列的测序。最后将已确定序列的DNA片段重组，得到原先的完全的DNA碱基序列。上述方法因为操作简单，所以得到广泛应用。

但是从目前的人基团组测序计划来看，作为大规模的碱基序列测序方法，从生产效率及自动化方面考虑未必是最佳方法(数理科学No.359、May、(1993)PP74-81)。特别是利用DNA测序仪测定时事先要制成亚克隆，这是非常麻烦的。先前，亚克隆是将巨大的DNA利用超声波随机切断而进行调制的(“Molecular Cloning”secondedition.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)PP13.21-13.23)。将亚克隆插入大肠肝菌进行培养得到菌落，再将得到的菌落分离，分别得到片段化的目的DNA。然后用含有分离得到的DNA片段的质粒对每个菌落进行DNA碱基序列的测序。通常，1次碱基序列操作所能决定的DNA碱基长度为300个碱基到500个碱基，所以必须要解析大量的亚克隆。

另外，即使获得了菌落，因为含有相同DNA片段部分的菌落有很多，所以不得不重复地对同一DNA碱基序列部分进行测序，必须分析实际要确定的碱基序列部分的10倍至20倍的碱基长度。实际中，确定10K碱基长的DNA碱基序列时，必须要解析400以上的质粒(亚克隆)，但为了不使碱基序列信息重复，不能选择亚克隆。另外，制备亚克隆要利用大肠菌的宿种、载体系统，所以操作复杂难以实现自动化。

在不必重复地确定同一碱基序列的碱基序列测序方法中，有引物行进(Primer walking)法(Science 258(1992)PP1787-1791、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866917-6921(1989))。在引物行进法中，将巨大的DNA直接作为样品DNA使用。首先确定样品DNA的部分碱基序列。然后，以确定了的DNA碱基序列为基础，在确定了碱基序列的部分上合成进行特异地杂交的引物，确定余下部分的DNA碱基序列。即，从一端开始将要确定碱基序列的DNA片段的碱基序列按顺序确定的方法。在引物行进法中，可以将重复确定的碱基序列部分减少到最少，但在每次确定碱基序列时都必须要合成引物，非常麻烦。另外，碱基序列测定操作因为已经变成顺序的(Sequential)，所以不只限于适合大规模测序。