[发明专利]DNA碱基序列的测序方法及用于该方法的样品调制方法

权利要求书

1.碱基序列测序方法，其特征在于包括以下工序：

(1)将样品DNA利用限制性内切酶切断得到DNA片段的工序及

(2)在DNA片段的3’末端上导入具有特定碱基序列的寡核苷酸的工序及

(3)将导入了上述寡核苷酸的上述DNA的片段的1条链作为模板，使用由与寡核苷酸的碱基序列的至少一部分至补的第1碱基序列部分及与利用上述限制性内切酶识别的碱基序列互补的第2碱基序列部分及、从1个碱基至4个碱基的范围的碱基组合而形成的第3碱基序列部分组成的，并被标记的标记引物，进行互补链合成延伸反应，得到具有与DNA片段的1条链互补的碱基序列的标记延伸引物的工序及

(4)使(a)将上述导入了寡核苷酸的上述DNA片段的1条链作为模板，使用上述标记引物进行序列反应的工序及、(b)将具有上述DNA片段的1条链的碱基序列及与其邻接的碱基序列的样品DNA的1条链的一部分或样品DNA的1条链作为模板，使用上述标记延伸引物进行序列反应的工序，分别或同时进行的工序及、

(5)将上述序列反应的生成物进行电泳，确定上述DNA片段的碱基序列及、与DNA片段的碱基序列邻接的样品DNA的至少一部分的碱基序列工序。

2.权利要求1中记载的碱基序列测序方法，其中的标记是指萤光标记。

3.权利要求1中记载的碱基序列测序方法，变换温度条件将其中的工序(3)重复进行数次。

4.权利要求1中记载的碱基序列测序方法，变换温度条件，将其中工序(4)即上述互补链合成延伸反应及上述标记延伸引物从上述DNA片段中游离出来的操作重复进行数次。

5.权利要求1中记载的碱基序列测序方法，在其中的工序(3)、(4)中使用耐热性聚合酶。

6.权利要求1中记载的碱基序列测序方法，其中的寡核苷酸是由单一的碱基种类组成的。

7.碱基序列测序方法，其特征在于包括以下工序：

(1)将样品DNA利用第1限制性内切酶切断得到DNA片段的工序及

(2)使用引物将上述DNA片段的1条链作为模板进行延伸反应之后，将3’末端与萤光标记的核苷酸置换的工序及、

(3)将(2)生成的互补链利用与上述第1限制性内切酶不同的第2限制性内切酶切断，得到在3’末端上被萤光标记的萤光标记引物的工序及、

(4)使用上述萤光标记引物，将具有DNA片段的1条链的碱基序列和与其邻接的碱基序列的上述样品DNA的1条链的一部分或上述样品DNA的1条链作为模板，进行序列反应的工序及、

(5)将上述序列反应的生成物进行电泳，确定与上述DNA片段的碱基序列相邻接的上述样品DNA的至少一部分的碱基序列。

8.碱基序列测序方法，其特征在于包括以下工序：

(1)将样品DNA利用限制性内切酶切断得到DNA片段的工序及、

(2)使用引物，将上述DNA片段的1条链作为模板进行互补链合成，得到具有与DNA片段的1条链互补的碱基序列的工序及、

(3)使用上述引物，将具有上述DNA片段的1条链的碱基序列及与其邻接的碱基序列的上述样品DNA的1条链的一部分或上述样品DNA的1条链作为模板，进行在延伸链的末端上导入萤光标记的序列反应的工序及

(4)利用上述限制性内切酶切断上述序列反应的生成物的工序及、

(5)将上述利用限制性内切酶切断的序列反应的生成物进行电泳，确定与DNA片段的碱基序列相邻接的样品DNA的至少一部分的碱基序列的工序。