[发明专利]用大肠杆菌生产色氨酸

说明书

本发明涉及用大肠杆菌生产色氨酸。

本发明提供了一种宿主以及生长该宿主以便在缺乏抗生素的条件下稳定地维持质粒，导致发酵中色氨酸的高产率的方法。它对以前的方法提供了明显的改进并生产无任何酪氨酸和苯丙氨酸污染的色氨酸，从而简化了下游加工。

现在有许多遗传操作微生物以制备有效地超额生产特定氨基酸的菌株的例子。

本领域一般公认的是，如果要成功地获得特定氨基酸的生产，干扰控制生物合成途径的基因之表达的正常调节线路，选择其酶不再受到反馈抑制的突变子并破坏能分解所需产物的酶是必需的。还发现经过将质粒上额外的基因拷贝导入细胞来增加某些生物合成基因的拷贝数是有用的。这些一般性原则可见Tribe，D.E.and J.Pit-tard.(1979).Appl.Environ，Microbiol.38：181-190.特别是其中涉及的色氨酸生产。

在该文章中也说明了芳香族途径中的第一个酶(DAHP合成酶)及末端色氨酸途径中的第一个酶的反馈抑制的意义和取消抑制的必要性。

同样地，很久就已知道灭活抑制色氨酸操纵子基因表达的trpR阻遏蛋白是必需的。这一点在上面提到的文献中进行了讨论。

对于大肠杆菌的色氨酸基因，有一个第二控制系统称为衰减。即使在trpR细胞中，色氨酸或更具体地说，负载的色氨酸-tRNA控制色氨酸操纵子的表达。当负载的色氨酸-tRNA过量存在时，在每10个转录子中编码生物合成酶的序列达到大约9个前终止trp操纵子基因mRNA的转录(Yanofsky.c.(1981)，Nature(London)289，751-758)。这种转录的成熟前终止可经各种遗传操作如克隆在异源启动子之后的trp基因或去掉衰减子基因座来阻止。Tribe和Pittard(Appl.Envtron.Microbiol.(1979).38：181-190)报道了克服衰减的不同方法，其中他们使用了含部分缺陷型色氨酸-tRNA合成酶的突变子。

当含trp操纵子的结构基因的质粒导入这些trp基因的表达不再受控制且缺乏任何对质粒编码功能的强选择之细胞中时，随后对该细胞及其子代的操作常导致质粒从群体中丢失。如果原始宿主是色氨酸原养型，丢失质粒的细胞比保留质粒的细胞生长更迅速，遗传修饰(如缺失或插入)已减少或阻止存在于质粒上的trp基因表达的细胞也一样。经过多次传代，这种缺陷型细胞(分离子和突变子)成为群体中的主要成员，如果该群体作为发酵的基础，则发酵失败。

为稳定质粒的遗传已发展了各种方法。通常使用的方法包括在质粒上的抗生素抗性基因和向发酵培养液中加抗生素。然而，该方法昂贵且对环境有害。使用在为生长所需的一些化合物生物合成上有缺陷的宿主以及携带补偿该突变缺陷之基因的质粒的方法以前已使用(例如见Anderson et al.，美国专利4,371,614)，但随着它们继续合成该营养成份几代时分离子会积累(表型滞后)。由于其所需与积累的营养成份相同，分离子也可利用已经积累的营养成份。使用运输缺陷型宿主已取得了有限的进展，但这仅在培养基中色氨酸较低的条件下实现(Imanaka，专利公开A No.3-43074)。

对能生产高水平的色氨酸的微生物的需要仍然存在。与之相关的是对在所说的微生物中稳定质粒遗传之方法的需要。

经过提供具有色氨酸生产能力且在其基因组中包含编码部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶基因(将温控性色氨酸营养缺陷型导入宿主)及进一步在染色体上破坏由arop.mtr和tnaB编码的运输系统的突变的E.coli K-12(该菌株含编码在高色氨酸浓度时对反馈抑制有抗性的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因)来达到本发明的这些和其它目的，这些目的在下文的描述中将会变得更显而易见。

经过提供经发酵生产L-色氨酸的方法实现了本发明的另一目的，该方法包含在不同的生长和生产条件下培养前文所述的细菌并从培养基中回收产生的L-色氨酸。附图描述：图1