[发明专利]辣椒植物遗传转化和再生的方法

说明书

本发明是属于植物遗传转化和再生的方法，特别是关于辣椒植物的遗传转化和再生方法。

目前，许多植物遗传学家选择高等植物为材料进行有关目的基因的转化和再生，以期达到改造植物体，使其具有某种新的特征。例如，作为备受人们喜欢的蔬菜辣椒(pepper)是茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)，富含维生素C，还可用于制作辣椒干粉和天然色素。但辣椒栽培中辣椒能被多种植物病毒如黄瓜花叶病毒(CMV)，烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯Y病毒(PVY)，番茄斑萎病毒(TSWV)等感染，有时数种病毒混合侵染，从而导致辣椒大幅度减产和质量低劣。所以辣椒被列入转化抗病基因的寄主。

自七十年代末期至今，国内外有关从辣椒子叶、下胚轴、原生质体、愈伤组织、花粉、胚、茎尖等外植体和组织再生成完整植株报道也有一些，但不易重复或再生成完整植株的频率太低。尽管都想通过转化导入抗病的外源基因，由于上述原因有的只能得到抗卡那霉素的分化芽，成功的例子极少。

1989年Saito等在美国植物生理学会年会上报告了外植体经农杆菌介导的转化，外植体产生愈伤组织；1990年Liu等在Plant CellRep.9：360-364报道了农杆菌介导的转化，农杆菌与外植体下胚轴和子叶及叶组织共培养后得到少量分化的芽和类似叶的结构，能检测到GUS基因的瞬间表达，但没有得到再生的完整植株；1991年王玉文等在植物学报33(10)：780-786报道以子叶为外植体进行转化，在子叶上检测到GUS基因瞬间表达，只得到了抗卡那霉素再生芽；1992年董春枝等在园艺学报19(2)：184-186报道了以子叶为外植体，经农杆菌介导的转化，得到了再生植株；1993年叶志彪等在植物学报35(增刊)：88-93报道了以子叶为外植体经农杆菌介导的转化后得到8株再生植株，经检测均含有NPTII基因；1994年张宗江等在华北农学报9(3)：67-71报道了以子叶为外植体经农杆菌介导的转化，62个再生植株中有12个抗卡那霉素阳性株，其染色体已整合了CMV-CP基因，子代接种CMV后筛选到5个抗CMV株系。

1993年11月16日Engler等人美国专利，专利号：5262316，“Genetically transformed pepper plants and Methods for theirproduction”是用幼胚子叶或展开子叶为外植体经农杆菌介导的转化，与农杆菌共培养后不通过愈伤直接诱导转化的再生芽，发根后产生完整植株，外源DNA被稳定地整合到再生辣椒植物的染色体中并能表达外源DNA编码的基因。

综述目前国内外的现有技术，还未见过用辣椒下胚轴为外植体进行遗传转化，并获得成功的例子。

本发明特点是以辣椒下胚轴为外植体而不是以子叶为外植体经农杆菌介导的转化。本文所使用的农杆菌是指利用CaMV35S启动子和rbcS的转录终止信号构建的能同时表达CMV-CP基因和TMV-CP基因中间载体以及只表达TMV-CP基因中间载体，通过三亲交配转入到含去毒Ti质粒的农杆菌(见科学通报1990年第一期1358-1359页)。由农杆菌转化后的下胚轴经诱导培养，选择性的诱导、再生、伸长、生根培养，多次反复实验表明转化后均能得到辣椒的再生完整植株。在以农杆菌为介导引入CMV-CP和TMV-CP基因获得对CMV和TMV具有抗性的辣椒的研究中，PCR分析证明CMV-CP基因和TMV-CP基因或TMV-CP基因已整合到辣椒的染色体中。子代(T1代)植株在温室同时接种提纯的CMV和TMV后表现抗性，抗病的T1代的子代用卡那霉素筛选出100％抗卡那霉素的T2代纯合系，PCR分析表明外源抗病基因稳定地遗传。其它有用基因也能应用该转化和再生方法引入辣椒，是辣椒遗传育种新途径之一。

本发明采用辣椒下胚轴为外植体进行转化和再生的具体方法是：

选用成熟的辣椒种子，浸泡在0.1％HgCl2(含0.1％吐温-20)中1-2分钟进行表面消毒，用无菌水充分淋洗后转移到实生苗生长培养基(1/2MS，3％蔗糖，0.6％琼脂，pH5.8)，28℃黑暗培养9天后可得到大约4cm高的黄色实生苗，转移至组培间于25℃±2℃，光照的条件下再继续培养3-5天，绿色的12-14天苗龄实生苗是切取下胚轴用于转化的最好材料。