[发明专利]重组人组织型纤溶酶原激活剂两步纯化方法

说明书

发明涉及一种纯化重组人组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue-typeplasminogen activator，rt-PA)的两步纯化方法，属于生物工程技术。

组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator，t-PA)是血液内纤溶系统的生理性激活剂。它与血栓基质纤维蛋白有较强的特异亲和力，能在血栓局部高效激活纤溶系统，是一种高效特异的溶血栓药。由于t-PA的半衰期短，临床用量大，通过人体组织细胞培养生产的t-PA远不能满足临床的需要，利用基因重组技术在原核表达系统中生产的rt-PA不能有效地进行翻译后修饰，难于形成与天然rt-PA一致的构型，因而用真核表达系统生产rt-PA是目前普遍采用的途径。在大量生产人rt-PA过程中产品的纯化工艺是一个重要环节。

目前国外所用的t-PA纯化技术如：

1. Rijken和Collen采用：1).锌螯合物亲和层析；2).刀豆球蛋白亲和层析；3).Sephadex G-150凝胶过滤等三步法纯化人黑色素瘤细胞(Bowes)无血清培养上清中的t-PA。

2. Einarsson用免疫亲和层析、精氨酸亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤等三步法，对重组人黑色素瘤细胞无血清培养分泌的rt-PA进行的纯化。

3.欧洲专利(申请号：87308392)记载，采用抗体亲和层析、盐析和离子交换层析法对产rt-PA重组CHO细胞生产的rt-PA进行的纯化等。

鉴于上述诸纯化方法均由三步纯化步骤组成，步骤繁多，纯化过程中包含了脱盐或凝胶过滤层析，规模不易放大，t-PA的回收率和比活性均低(回收率低于75％，比活性约为2.0×10⁵IU/mg·蛋白)；采用抗体亲和层析，在纯化过程中因异源性抗体自固定相脱落，混于t-PA产品中，致使产品质量难于控制；此外，以上纯化方法都只限于无血清细胞培养物中t-PA的纯化，不能用于有血清的细胞培养上清中t-PA的纯化。

本发明提供的两步纯化rt-PA方法的技术要点是采用微孔高硅玻璃珠(Micropore Glass，MPG)吸附层析作为本纯化方法的第一步，然后用赖氨酸(Lys-Sepharose 4B)亲和层析作进一步纯化，两者结合形成的两步纯化方法。此法适用于纯化含小牛血清培基培养产rt-PA CHO工程细胞(N4B3)生产的rt-PA，可用于rt-PA的工业化放大生产，其目的在于克服已有纯化方法难于适应工业规模放大生产的缺陷。

以下的技术方案能实现本发明的目的：

1.本发明所以采用微孔玻璃珠是因其表面含有丰富的硅羟基，属于微孔或称多孔高硅玻璃珠，在层析柱内能非特异性地大量吸附细胞培养上清中的rt-PA。

2.由于rt-PA分子中含有赖氨酸结合位点，能与赖氨酸亲和层析柱上的赖氨酸特异性地结合，把赖氨酸亲和层析作为本两步法中的第二步纯化，可分离到具有与天然rt-PA相同构型和生物活性的高纯度的rt-PA。

实施例：

例1.

(1)微孔高硅玻璃珠(MPG)层析柱的准备：选用粒径为75～125μm，微孔径为35nm的MPG，用蒸馏水反复漂洗后晾干。

(2)MPG的用量是按照每处理100～120ml细胞培养上清所需MPG1克的用量计算。

(3)MPG用PBS浸泡后装填层析柱。

(4)用0.8μm微孔滤膜过滤含rt-PA的N4B3有血清培养上清。

(5)过滤后的上清以200cm/h的流速通过MPG吸附层析柱。    

(6)分别用0.02M PBS、pH7.4(E₁)和0.02M Tris、0.5M NaCl、pH7.4(E₂)洗脱杂蛋白。

(7)用0.02M Tris、0.5M NaCl、0.5M Arginine、pH7.4(E₃)洗脱结合于MPG上的rt-PA，流速为100cm/h。

(8)收集富含rt-PA的E₃洗脱组分。

例2：

(1)用去离子水将MPG吸附层析中富含rt-PA的E₃洗脱组分稀释4～5倍。

(2)以100cm/h的流速通过Lys-Sepharose 4B亲和层析柱。

(3)用与MPG吸附层析中相同的E₁和E₂洗脱杂蛋白。