[发明专利]用于生产具有提高的抗原性的肠细菌的方法及包含此种细菌的疫苗

说明书

本发明是1994年10月5日提交的共同未决的系列申请08/318,409的部分后继。

                       1.发明领域

本发明总体上涉及诱导或提高肠细菌抗原和/或毒性因子的表达因而产生抗原性提高的肠道细菌的体外方法，涉及使用抗原性提高的肠道细菌的方法，涉及含有抗原性提高的肠细菌的疫苗。

                       2.发明背景

普遍认为，使用常规培养基和培养条件体外培养的细菌，其表达的特征不同于在其自然的生活环境，包括在动物宿主的正常微生物体系和病原体体内生长，生长过程中所表达的特征。因而，这种体外生长的病原菌不宜用作疫苗组分。然而，假如能够确定引发或提高毒性因子的表达，相关生理学，或包括外表面抗原的抗原的条件，那么重要的产品和治疗学(如，疫苗的新抗原，抗生素的新靶点，和用于诊断应用的新的细菌特征)能够被快速地确定。

已经确定了几种影响细菌中毒性决定簇的表达的环境因子(Mekalanos，J.J.，J.Bacteriol.174：1-7，1992)。例如，对于铁和细菌，特别是志贺氏菌属(Payne，Mol.MicroBiol.，3：1301-1306，1989)，奈瑟氏球菌属(Payne and Finhelstein，J.Clin.Microbiol.，6：293-297，1977)和巴斯德氏菌属(Gilmour，et al.，Vaccine，9：137-140，1991)细菌的毒性之间关系的研究已进行了很长时间。

其它环境因子亦显示出在植物和动物中控制多种细菌的协同调节的毒性决定簇的表达，包括酚类化合物，单糖，氨基酸，温度，克分子渗透压浓度，和其他离子(Mekalanos，J.Bacteriol.174：1-7，1992)。

通过肠道(即，口途径)进入动物宿主的细菌病原体遭遇多种宿主环境成份和条件，这些都可能影响细菌病理学和毒性因子表达。这些成份和条件包括胆汁，胆汁酸或盐，胃pH，微需氧的条件(肠道内CO₂较高，O₂较低)，克分子渗透压浓度和其它尚未确定的因素。侵袭性肠病原菌需要从头蛋白质合成以完成内在化(internalization)(Headley and Payne，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4179-4183，1990)。因而，细菌可仅在应答普通情况下体外不存在的某些环境信号时最佳地产生这些侵袭因子。这些假说被最近的报道所支持：针对常规生长的空肠弯曲杆菌制备的抗血清在阻断体外内在化上仅有边缘效应(Konkel，et al.，J.Infect.Dis.，168：948-954，1993)。然而，用在上皮细胞单层出现，一种提高侵袭力，的条件下生长的弯曲杆菌提取物免疫兔，引起能明显抑制细菌内在化的抗血清的产生。

研究人员一直在研究在肠道环境下的细菌生长以确定相关毒性因子。例如，生长于兔回肠环的弯曲杆菌菌株81-176表达了在实验室常规体外培养条件下不表达的蛋白质(Panigrahi，et al.，Infect.Immun.60：4938-4944，1992)。用INT 407细胞单层培养的弯曲杆菌，与没有上皮细胞条件下培养的细菌相比，出现了新的，或提高的蛋白质的合成(Konkel，et al.，J.Infect.Dis.168：948-954，1993)。而且，这些变化暂时地与空肠弯曲杆菌增加的侵袭力相关。在静脉内或绒毛尿囊鸡胚传代时，空肠弯曲杆菌的无毒株的一些变化被诱导和增加，如细胞形态，鞭毛失去，新的外层膜蛋白的表达和细胞表面碳水化合物的改变(Field，etal.，J.Med. Microbiol.，38：293-300，1993)。

其他肠道组分，例如胆汁酸或盐，已知能抑制某些细菌，但是胆汁酸通过影响细菌毒性表达而起到其他作用。

Pope和Payne(93rd Am Soc.Microbiol.，B-147，1993)报道培养在含有鹅脱氧胆酸钠肉汤中培养的弗氏志贺氏菌被证明具有提高3-5倍的对Hela细胞单层的侵染力。然而，他们报道，其他胆汁酸和去垢剂，包括胆酸盐，甘氨胆酸盐，牛磺脱氧胆酸、CHAPS系列，毛地黄皂苷和Triton X 100和其钠盐，对于弗氏志贺氏菌的侵袭力没有作用。而且，含有鹅脱氧胆酸的肉汤对于大肠杆菌或其它志贺氏无毒菌株的侵袭力没有作用。