[发明专利]9，10-二氢化吖啶化合物发光的新方法和试剂盒

说明书

交叉引用的相关申请

本申请是申请人的两件共同待审申请08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)的部分继续申请，这两件申请又是申请号为08/061，810(1993年5月17日)的部分继续申请。发明背景

(1)发明领域

本发明涉及化学发光的9，10-二氢化吖啶化合物，更具体的说，涉及N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物，它们可由9，10-二氢化吖啶通过与过氧化物和过氧化物酶反应而发光(化学发光)。本发明涉及由化学方法发光(化学发光)的一种改进的方法，该方法是通过一种过氧化物酶和一种氧化剂(如过氧化氢)对一组N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物的作用而实现的。本发明也涉及用特定的增强剂物质使得该方法产生的化学发光量增加的改进方法。本发明也涉及用该方法测定过氧化氢或过氧化物酶。而且，本发明还涉及用该方法监测和定量测定多种生物分子。例如，该方法通过免疫试验技术可用来测定半抗原、抗原、蛋白质和抗体，以及通过核酸杂交试验可用来测定DNA或RNA。该方法另外还可用于检测可产生过氧化氢的酶如氧化物酶。该方法特别可在用自动化仪器完成的试验中检测生物分子。

(2)相关技术的描述

通过采用放射标记的报道分子，过去已能够以很高的灵敏度完成对生物分子的检测和定量测定。最近已发展了无数非放射活性的方法以避免采用这些(放射性)物质带来的危害和不便。酶联检测技术提供了最好的灵敏度，这是因为底物的催化转化产生了可检测的变化，实际上放大了被测信号。现已开发了一些可产生颜色、莹光或化学发光的底物，后者可获得最好的灵敏度。

而且，试验灵敏度的增加会扩展以化学发光为基础的方法的应用范围，这是由于可以用更少量的分析物来进行测定或者由于降低了完成试验所需的时间和/或反应物的量。在化学发光试验中提高测定速度和灵敏度的一种方法就是使得所发的光是短脉冲、高强度的光。

在酶联检测方法如免疫试验、寡核苷酸检测和核酸杂交技术中，辣根过氧化物酶(HRP)是最广泛使用的酶之一。本领域已知的HRP检测的化学发光试剂在分析中并未完全利用该酶的生物性能，这主要是由于灵敏度的限制。因此，需要更有效的化学发光底物以改善该报道酶的可用性。此外，产生高强度闪光与酶催放大步骤结合的能力(这是本领域未知的)，对检测灵敏度和自动测定也有有益的作用。a.9，10-二氢化吖啶的氧化

在共同申请系列号08/061,810(1993年5月17日提出)，08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)中，公开了用过氧化物酶使取代和未取代的N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物氧化而产生化学发光。这些专利公开的内容在此作为参考文献引用。在过氧化物酶和过氧化物存在下，可以在一步反应中有效地氧化N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物而产生N-烷基吖啶酮和化学蓝光。

在偶极非质子溶剂强碱性条件下，10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯经过自动氧化产生化学发光(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9(6)，201-8(1976)；F.McCapra，M.Roth，D.Hysert，K.A.Zaklika“化学发光和生物发光”，plenum press，New York，1973，pp.313-321；F.McCapra，“有机化学进展”，8，231-277(1971)；F.McCapra，“纯应用化学”，24，611-629(1970)；U.S.Patent NO.5,283,334 and 5,284,951toMc Capra and 5,284,952 to Ramakrishnan)。产生的化学发光的量是在10-5至0.1范围内，并且发现当苯酚或醇离去基团的Pka减小时，该发光量增加。在水溶液中产生的量明显较低，这是由于中间体的竞争性非发光分解反应的存在。加入阳离子表面活性剂CTAB由于阻止了不可见(光)反应而使产生的可见光增加130倍。b.吖啶鎓酯的化学发光氧化

在碱性溶液中采用H₂O₂对N-烷基吖啶鎓羧酸的脂族和芳族酯进行化学发光氧化反应是众所周知的反应。接近0.1的高化学发光量使具有可结合生物分子侧活性基的衍生物得到了发展。利用吖啶鎓酯标记的许多化学发光免疫试验和寡核苷酸探针已有报道。