[发明专利]非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子

说明书

本发明涉及用于重组蛋白生产的宿主细胞.具体地讲，本发明涉及非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属(Fusarium)真菌宿主细胞，可将其用于重组蛋白，尤其是酶的高水平表达。本发明还涉及可用于该系统的启动子序列和终止子序列。

近年来，由于将重组宿主细胞用于表达异源蛋白，已极大地简化了大量有商业价值的蛋白质的生产，这种蛋白质原来只能从其天然来源中纯化.目前，已有多种可选择的表达系统，可从中选择生产任何特定蛋白质所需的表达系统，包括原核宿主和真核宿主。适当表达系统的选择通常不仅取决于宿主细胞产生适量产率所述蛋白质的能力，而且在很大程度上取决于预想的该蛋白质的最终用途。

尽管哺乳动物细胞和酵母细胞一直是最常用的真核宿主，但现在已开始认识到丝状真菌是可用于重组蛋白质生产的很有用的宿主细胞.现在被利用或被推荐用于上述方法的丝状真菌的例子有：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、Acremonium chrysogenum、Tolypocladium geodes、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和Trichoderma reesei，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)。

镰孢属的某些种已被用作植物致病性研究和基因调控研究的模式系统，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)(Dioletz等，1993，Gene131：61-67；Langin等，1990，Curr Genet.17：313-319；Malardier等，1989，Gene 78：147-156和Kistler及Benny，1988，Curr，Genet.13：145-149)、腐皮镰孢(F.solani)(Crowhurst等，1992，Curr，Gene.21：463-469)和大刀镰孢(Fusarium culmorum)(Curragh等，1992，Mycol.Res.97：313-317)。这些镰孢菌不适用于异源蛋白的商品化生产，因为它们具有一些不理想的特征，例如，是植物病原体，或是会产生超过安全水平的真菌毒素。Dickman和Leslie(1992，Mol.Gen.Genet.235：458-462)披露了用一种带有粗糙脉孢霉的nit-2的质粒转化玉蜀黍赤霉(Gibberella.zeae)的方法。由Dickman和Leslie披露的玉蜀黍赤霉菌株是一种植物病原体，并能产生玉米赤霉烯酮-一种雌激素类真菌毒素。Sanchez-Fernandez等(191，Mol.Gen.Genet.225：231-233)披露了用一种带有黑曲霉niaD基团的质粒转化具有niaD突变的藤仓赤霉(Gibberellafujikoroi)的方法。

理想的表达系统应当是这样的：它基本上不产生蛋白酶和真菌毒素，而且基本上没有大量其它内源产生的分泌性蛋白，它能以比现有宿主细胞更高的水平表达。本发明现在就提供满足上述要求的新型镰孢属表达系统。

本发明提供了一种重组的非毒性、非产毒性和非致病性镰孢属宿主细胞，它包括一个与一个启动子可操纵连接的编码一种异源蛋白的核酸序列.这里所说的“非毒性”是指该宿主细胞不是植物或动物的毒物。例如，如果以大约20ml(1∶1稀释)培养3天的镰孢属培养基/kg体重/小鼠的剂量给大约5只小鼠注射镰孢属培养基约14天之后，这些小鼠中无一只因镰孢处理而死亡的话，就认为这种镰孢宿主细胞是非毒性的。这里所说的“非产毒性”是指经标准分析方法，如HPLC分析测定基本没有真菌毒素的宿主细胞。例如，可用有机溶剂提取一定量的生长在盛有固体营养基的2×9cm培养皿上的镰孢菌，并将该提取物的0.5％加注到HPLC中进行分析。通过没有在真菌毒素标准的已知位置上出现可检测到的HPLC峰这一现象，可以推断没有已知的真菌毒素。这里所说的“非致病性”是指该宿主细胞不会导致健康植株或健康动物明显发病。例如，一种能使植物致病的镰孢菌，会出现对植物木质部组织的真菌性侵入，并导致以典型的枯萎症状为特征的病态。这里所说的“异源蛋白”是指一种对该宿主细胞来说不是天然的蛋白质，或是一种已通过修饰使其天然序列发生改变的天然蛋白质，或是一种对其表达做过定量改变的天然蛋白质，这种表达的定量改变可以是对表达该天然蛋白质所需的天然调节序列，如启动子、核糖体结合位点等进行操作的结果，或是用重组DNA技术对宿主细胞进行其它操作的结果。所述核酸序列可操纵连接在一个合适的启动子序列上，该启动子序列可指导所述核酸序列在所述选择的宿主细胞中转录。