[发明专利]增强的病毒介导的DNA转移

说明书

               发明领域

本发明涉及通过病毒提高细胞转导效率的方法，具体地说，涉及用纤维结合素和/或纤维结合素片段来增强病毒介导的基因向细胞转移的方法。

                发明背景

近来，随着人们对许多人类疾病分子基础的了解以及基因转移技术的发展，人们开始尝试建立对一些遗传病的体基因疗法(somatic gene therapy)方案。目前用基因疗法有希望治愈的疾病有这样一些：在这些疾病中，一种酶或其他蛋白有缺陷或者丢失，而这些酶或蛋白的水平不需精确调节，尤其不需内在的精确调节，而且那些酶或蛋白的缺陷是在患者骨髓中可发现的。

例如，一种可用基因疗法来治疗的疾病是腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症。这种病会导致严重的并发免疫缺乏症(SCID)。ADA缺乏的患者骨髓中有很少或没有这种酶。然而，ADA缺乏已通过相配的骨髓移植得到治疗。ADA正常的细胞对ADA缺乏的细胞有一种选择优势，并且会再生出病人的骨髓。

骨髓细胞之所以是体基因疗法的好的目标，是因为骨髓组织易于体外操作并且包含可再生细胞。另外，人脐带血中也包含大量的始祖细胞。把基因成功地转入可长期再生的造血干细胞中，这些细胞的后代的存在使得多种疾病得以终身治愈。

一些研究者已在鼠中将基因转移至可再生干细胞中并在可再生干细胞中长期表达。然而对于大型动物，如狗和灵长类，体内实验还仅有极少的成功记录。这很可能是由于初级造血干细胞的感染效率较低的缘故。当应用于人类时，现有的基因转移技术的局限性就更加复杂了，这是由于以下因素的存在造成的：成人骨髓(ABM)中干细胞较少；缺乏纯化这些细胞的方法；并且这种原始细胞在细胞周期中所占的时间相对较少。

在鼠和大型动物的骨髓细胞实验中，人们注意到，最成功的方案是把靶细胞与产生逆病毒的细胞系共同培养。另外，多数的FDA支持的基因转移试验依赖于重组的逆病毒载体来进行基因转导。由于重组逆病毒载体转移效率高并且可以精确而稳定地把外源DNA整合到细胞DNA中，所以它成为基因疗法很合适的载体。这些载体中包含所要转移的外源DNA，并经过进一步的修饰除去了病毒的病原性。由于这些修饰，病毒的产生就通过逆病毒包装细胞而基本上完成了。然而，对于临床基因疗法，由于考虑到生物安全性和质量控制，不依赖细胞的转导更为合适。不幸的是，如果不与产生病毒的细胞共同培养，一般很难把基因有效地转移到造血细胞比如干细胞中。

最近，有人指出，在感染过程中，把靶细胞暴露于基质细胞中，基因转移效率会被提高。基质细胞是造血微环境(HM)的一种主要成分。HM由一种有组织的网络组成，主要包括：巨噬细胞、基质细胞、内皮细胞、脂肪细胞和一类由多种特定粘附分子组成的复合胞外基质(ECM)。一些ECM分子，如laminin，胶原，thrombospondin，蛋白多糖，葡糖胺多糖和纤维结合素，为造血细胞和生长因子提供了锚定位点。基质使逆病毒感染效率提高的机制还不清楚，但一段时间以来，人们已经知道，当造血细胞与HM的细胞直接接触时，会对这些造血细胞增殖和分化有生理调节作用。

要把基因有效地转入可长期再生的造血干细胞及其他细胞之中还存在一些疑问，这就使基因转移法在对造血病或其他病的治疗方面受到了限制。人们需要一种方法，它可以有效地把遗传物质转入哺乳动物体内，并且不带有过去方法所具有的危险性和局限性。本发明中的方法满足了这些需求。

                 发明概述

简单地说，本发明的一个优选实施方案提供了一种通过逆病毒载体来提高造血细胞转导频率的方法。这种方法包括在可通过逆病毒来有效地提高细胞转导频率的纯的纤维结合素和/或纤维结合素片段存在的条件下，用一种缺乏复制能力的重组逆病毒载体来感染活的造血细胞。这些纤维结合素和/或纤维结合素片段可以从天然材料中获得，或通过合成而得到(例如，用重组或化学合成基因工程技术进行)，也可以通过天然与合成材料相结合而获得。另外，应该明白，本发明中所用的纤维结合素多肽可能包括对天然纤维结合素氨基酸序列的一些突变，从而为本发明提供了对提高转导效率有促进作用的具有粘附的功能多肽。

本发明的另一个优选实施方案提供了一种制备被被转导的造血细胞的方法。此方法包括用一种缺乏复制能力的带有外源DNA的重组逆病毒来感染活的造血细胞。此方法中要有足够的固定化的纤维结合素或其片段或者它们的固定化混合物，从而能够有效地通过逆病毒来提高细胞转导频率。