[发明专利]网织红细胞的检测

说明书

本发明涉及对血样中的网织红细胞进行检测与计数。更具体地说，本发明涉及一种染料，这种染料适合于对核糖核酸(RNA)和核糖核酸聚合物染色，并且特别适合于用荧光流式细胞计量技术检测网织红细胞。

网织红细胞是已经失去了核的未成熟红细胞。已知网织红细胞中含有RNA，对血样中网织红细胞进行检测与计数对临床医师是有价值的。血样中网织红细胞的个数被用作急性出血、溶血性盆血和骨髓移植中红细胞生成活性、诊断及预测值的指示，以及对铁、维生素B12和叶酸疗法的反应的一种量度。本领域中众所周知，网织红细胞是成熟红细胞的前体，因此网织红细胞这一术语包含了细胞的演化和发展过程，在此过程中产生了成熟的红细胞。

过去，血样中网织红细胞是通过人工和自动方法采用适当的染色剂如新亚甲蓝(NMB)、亮甲酚蓝(BCB)、吖啶橙、哌洛宁Y以及噻唑橙来测定的。

用新亚甲蓝这种染料进行的活体染色被认为是确定网织红细胞的参考方法，在使用这种染料时沉淀出RNA。这种方法是人工的，需要在显微镜下统计大量的细胞数目(例如500到1,000)，而且缓慢、繁琐且有统计误差。新亚甲蓝是无荧光的，而且真正沉淀的RNA经常难于与沉淀的染色剂区分开。

吖啶橙在用人工及自动方法对网织红细胞进行染色时已有所应用。吖啶橙能沉淀RNA；这就由于潜在的猝灭而阻碍了对RNA含量的定量测定。此外，吖啶橙不会导致被染色细胞的扩散荧光分布。细胞的年龄分布(依据与荧光成正比的RNA含量)就是不可靠的。吖啶橙对流式细胞仪中的塑料管有很大的亲和力，这将导致背景增加，并且延长从流式细胞仪管道清除染料的过程。此外，用吖啶橙染色的细胞也难于同自发荧光的红细胞峰分开，所获得的网织红细胞个数通常要低于用新亚甲蓝获得的值。

使用派洛宁Y需要先用福尔马林固定红细胞；这很不方便而且费时，并且结果一般都不好。而且，派洛宁Y的量子效率非常低，导致荧光信号也非常弱。

使用噻唑橙来检测网织红细胞的一个例子可见于1989年11月28日公布的美国专利No.4,883,867，它是在1985年11月1日申请的申请序号为No.793，813的部分继续申请，现已放弃。

使用硫黄素T来检测网织红细胞的例子可见于1986年2月18日公布的美国专利No.4,571,388。

Shapiro，Howard  M.，Practical  Flow Cytometry，P.144，AlanR.Liss，Inc.1985，在表7-3列出了用于对DNA和/或RNA染色的三环杂芳族化合物。同时表7-3列出了coriphosphine O(CPO)，但它并未将CPO作为一种网织红细胞或RNA的染色剂。

本发明提供一种染料和掺有该种染料的试剂，以定量测定全血中的网织红细胞。

本发明提供了一种定量测定网织红细胞的方法，其中的染料为coriphosphine O。

本发明还提供一种检测网织红细胞的方法，包括用coriphosphine O对样品染色；用激发波长的光激发样品；测量由上述样品中发出的荧光。

还提供一种检测网织红细胞的方法，其中样品受到激发，并且荧光是通过流式细胞仪来测量的。

本发明还提供一种对细胞分类染色的方法，使得受血小板、有核红细胞和Howell-Jolly Bodies的干扰较小。

本发明提供一种对细胞染色的方法，该方法产生一种RNA-染料复合物，它比其它已知的方法产生的复合物更为稳定，持续时间较长，使得由RNA-染料复合物产生的全部颜色都能被看清。

图1所示是可用于实现本发明方法的流式细胞仪光学系统的示意图。

图2所示是来自一个正常供体的流式细胞计量直方图的实例；

图3所示是一种来自异常(高)病人的流式细胞计量直方图的实例；

图4所示是RNA和coriphosphine O试剂的剂量/响应曲线；

图5所示是本发明的CPO方法与噻唑橙方法的相互关系；

图6所示是CPO的稳定性；

图7给出了红细胞和血小板的分析情况；

图8给出了红细胞和白细胞的分析情况。

为方便起见，本发明用于对网织红细胞染色的染料被称作coriphosphine O(CPO)，也称为碱性黄7号。coriphosphine O可以购自pfaltz & Bauer，Inc.Division of Aceto Corporation，Waterbury，Connecticut.