[发明专利]鲎试剂的活性定向生产工艺

说明书

本发明属一种鲎试剂的活性定向生产工艺。

目前，鲎试剂的生产工艺有各式各样，如1979年2月出版的，《福建医药》杂志第35页《东方鲎血细胞溶解物的制备及其灵敏度测定》，生产的鲎试剂灵敏度低，在10ng-0.1ng/ml，鲎试剂自身空白阴性观察时间短，仅为2-4小时，质量差，产品稳定性差。

本发明目的在于提供一种鲎试剂的活性定向生产工艺，生产的鲎试剂用于检测对人体有害的细菌内毒素，灵敏度高，质量好。产品活性定向，对生产节约原料，并更好地保护鲎原料资源。

本发明用抗凝剂、助悬洗涤剂、破解剂、增敏剂、至敏保护剂进行处理，通过两次离心分离，产品批量生产能力强，0.1ml装量每批达22000支，其生产工艺如下：

1、将新鲜活鲎洗净，用75％的醇消毒，心门采血，加入抗凝剂，在10℃制得鲎血。

2、在750-800转/分的速度下将鲎血离心分离，弃蓝色血清，将余下的白色细胞按体积比1∶4(v/v)加入助悬洗涤剂，处理后，按体积比1∶5(v/v)加入细胞破解剂，至使血细胞完全破解，在0℃存放获得细胞内溶物。

3、加入体积比为1∶0.6的CHCl₃，在2-5℃下振摇10分钟，在2590转/分-3000转/分的速度下离心分离，收集细胞内溶物即鲎试剂原液，加入增敏剂7％(g/v)，预检，再加至敏保护剂，使每毫升溶液100ng的(1-3)-βGlucn(真菌多糖)即可分装，在零下45℃-55℃冻干，在35℃以下封口，质检，印字即成成品。

生产工艺常采用几种试剂的制作方法：①抗凝剂是：使用浓度为0.03M的NaOH或HCI溶液加热40分钟，除去溶媒中的细菌内毒素，调PH值至中性，加入预配好的无菌辅料溶液稀释，使抗凝剂溶液中含茶碱浓度0.025M，NaC10.5M，用tuis-HCl调PH值为7.6，加入0.6％(g/v)活性碳吸附脱色，加热15分钟抽滤分装再在120℃高压消毒60分钟，抗凝剂与鲎血体积比为1∶4.5(v/v)。

②助悬洗涤剂是用0.025MNaOH或HCl溶液加热40分钟，破坏溶媒中污染菌，调PH值中性，加入浓度为0.5M的NaCl溶液，用tris-HCl调PH值为7.6，加0.6％(g/v)活性碳吸附脱色，抽滤分装，在120C高压灭菌备用，洗涤剂与鲎血细胞存余量之比为1∶4(v/v)。

③破解剂是用0.1M浓度NaOH溶液加热40分钟，调PH值中性，用0.03Mtris-HCl溶液调PH7.6，加0.6％(g/v)活性碳吸附脱色，抽滤分装，高压消毒备用。破解剂与离心分离出的鲎血细胞体积比1∶8(v/v)。

④增敏剂用0.15M浓度的NaOH或HCl溶液加热40分钟，调PH值中性，用于稀释NaCl溶液为0.5M、CaCl₂溶液为0.31M、MgCl₂溶液为0.41M(g/v)、加活性碳0.6％吸附脱色，加热15分钟抽滤分装，高压灭菌备用。增敏剂与鲎试剂原液体积比7％(g/v)。

⑤活性调节保护剂，(又称至敏保护剂)。用0.05-0.1MNaOH或HCl溶液加热40分钟，调PH值中性，加入1-3-βGlucn(真菌多糖)，使浓度为100ng/ml，作为鲎试剂活性物保护剂，此试剂主要用于加入试剂原液中，作鲎试剂敏感度的可控实验之用，并提高了鲎试剂与细菌内毒素的专一凝胶反应。

本发明各试剂的浓度适宜，不会造成细胞壁萎缩变性呈块，不会导致破解困难和抑制凝固旦白酶的活性；也不会导致鲎血细胞提前溶帐而破裂。并且，对溶媒进行无热原处理，防止鲎试剂受污染，提高溶媒纯度。因此，本发明制备鲎试剂得率质量高，产品灵敏度提高到0.05-0.006ng/ml，比有关技术的10ng-0.1ng/ml提高200倍以上，自身空白阳性观察时间长达12-24小时，比有关资料报道的高6倍，产品存放效期从一年延长至二年以上，产品质量达到美国FDA质量标准，实现活性定向生产，节约鲎血原料，有效地保护了鲎资源。同时避免了盲目生产造成产品积压和浪费，提高企业经济效益。

本发明原料主要来源于中国鲎，雌雄不限，为保证鲎血质量，在采血前鲎脱离水面后，不能超过两天，并保证个体不受伤。生产前，所有生产容器必须无菌处理，对各种辅助试剂的配制，首先对溶媒进行热原预除处理，然后采用稀释法进行配制，以保证各种试剂质量。采血，首先将活鲎用自来水冲洗干净，彻底消毒后，用适当大小针头接管采血(不宜过小以免堵塞)，蓝色血液自然流入接收瓶中，首次离心分离为750-800转/分，以免细胞破裂。首次分离出的血细胞由于量较少，故一般加用助悬洗涤剂轻摇使细胞混悬，以便归瓶之用。洗涤次数应视血细胞内在瓶中的存留量而定。冻干前，为提高产品灵敏度，必须加入CHCl₃按体积比例1∶0.6％(g/v)使细胞内溶物中的抗脂多糖因子沉淀弃除，在分装前应先做预检保证产品质量。