[发明专利]用于基因治疗的病毒载体

说明书

本发明涉及新的病毒载体，它们的制备和基因治疗用途。还涉及含有所述病毒载体的药物组合物。更具体地，本发明涉及作为用于基因治疗的载体的重组腺病毒。

基因治疗在于通过向病体细胞或器官中引入一种基因信息以纠正缺陷或异常（突变、异常表达等）。该基因信息或在体外引入从器官中取出的细胞中，然后修饰后的细胞再返回机体中，或在体内直接引入适当组织中。在后一情形下，存在不同技术，其中各种转染技术DNA与DEAE-葡聚糖的复合物（Pagano等，J.Virol.1（1967）891）、DNA与核蛋白的复合物（Kaneda等，Science  243（1989）375）、DNA与脂质的复合物（Felgner等，PNAS 84（1987）7413）、脂质体的使用（Fraley等，J.Biol.Chem.255（1980）10431）等。最近，使用病毒作为转移基因的载体已显示是这些物理转染技术的有利替代技术。关于这一点，已经试验了不同病毒感染某些人体细胞的能力。特别是逆转录病毒（RSV、HMS、MMS等）、HSV病毒、腺相关病毒和腺病毒。

在这些病毒中，腺病毒具有用于基因治疗的某些令人感兴趣的特征。特别是，它具有足够大的宿主谱，能够感染休止细胞，不与所感染细胞的基因组合，及至今对人体没有产生严重病理影响。

腺病毒为具有长度为36kb左右的线性双链DNA的病毒。其基因组特别包括末端的逆向重复序列（ITR）、包装序列、早期基因和晚期基因（参见图1）。主要早期基因为E1（E1a和E1b）、E2、E3和E4基因。主要晚期基因为L1到L5基因。

鉴于腺病毒的上述特征，它们已被用于体内转移基因。实际上已制备了衍生自腺病毒的不同载体，其中整合了不同的基因（β-gal、OTC、α-1AT、细胞素等）。在这些构建系中，腺病毒都被以某种方式修饰使其在所染细胞中无法复制。因此，现有技术中描述的构建系为缺失E1（E1a和/或E1b）区及有时缺失E3区的腺病毒，在此基础上插入异源DNA（Levrero等，Gene 101（1991）195;Gosh-Choudhury等，Gene 50（1986）161）。但是，现有技术中描述的载体存在许多限制基因治疗应用的缺陷。特别是，所有这些载体含有许多病毒基因，它们在体内的表达是基因治疗领域所不希望的。另外，这些载体不能融合很长的DNA片段，而这是某些应用中所必需的。

本发明克服了这些缺陷。本发明实际上描述用于基因治疗的重组腺病毒，它能够在体内有效地转移DNA（长达30kb），在体内以更高水平稳定地表达该DNA，完全消除了产生病毒蛋白、病毒传播、致病性等的危险。特别是，发现可以大大减小腺病毒基因组的长度而不妨碍包装化病毒颗粒的形成。这一点是令人惊异的，因为在其它病毒如逆转录病毒中已观察到沿基因组长度分布的某些序列对病毒颗粒有效地包装是必需的。因此，制造具有重要内部缺陷的载体受到很大限制。本发明还显示缺失病毒基因的主要部分也不影响这种病毒颗粒的形成。虽然对它们的基因组进行了很多修饰，但如此得到的重组腺病毒保留了它们感染能力强、在体内的稳定性等优越特征。

由于能够整合很长的目标DNA序列，本发明的载体特别有益，例如可能插入长度大于30kb的基因。这一点是令人感兴趣的，因为某些疾病的治疗需要多种基因的共同表达，或表达很大的基因。例如在肌肉萎缩的例子中，到现在还不可能转移此病的天然责任基因（萎缩基因）相应的cDNA，因为它很长（14kb）。

本发明载体的另一个优点是，它们所有的功能性病毒区段很少，因此大大减小甚至消除了使用病毒作为基因治疗载体的固有危险，如免疫原性、致病性、传染、复制、重组等。

因此，本发明提供特别适合于体内转移和表达目标DNA序列的病毒载体。

所以本发明的第一个目的是重组缺陷性腺病毒，它包括：

-ITR序列

-使其包装的序列

-异源DNA序列，

及其中：

-E1基因非功能化及

-E2、E4、L1-L5基因中至少一种非功能化。

在本发明中，术语“缺陷性腺病毒”指在靶细胞中不能自主复制的腺病毒。一般来说，本发明的缺陷性腺病毒的基因组至少缺失该病毒在所感染细胞中复制的必需序列。这些区域或被消除（全部或部分）、或失去功能、或被其它序列特别是被异源DNA序列取代。