[发明专利]一种用来检测病人样品内分析物的免疫测定法及其药盒

说明书

本发明涉及检测病人样品中分析物的存在或其量的改良的免疫检测法。具体地说，本发明涉及在改良的免疫检测方法中使用中性或碱性pH烷基化剂检测含有内源性抗体之样品中的分析物。

过去二十年里，已发展了用于检测病人样品中是否存在特定分析物的免疫化学检测方法。在一种典型的免疫检测法中，用能够产生可检测信号的化合物标记检测试剂，并使该试剂与预期含有特定分析物的病人样品结合。被标记的检测试剂将以与样品中分析物的量相关的量结合于分析物上。

已发现内源性抗分析物抗体和抗体与循环于血清样品中之分析物形成的免疫复合物可干扰分析物的免疫检测。美国专利4,703,001号描述了在免疫检测血清样品中酸稳定性分析物时解离免疫复合物和变性抗分析物抗体的预处理方法，该方法包括使血清样品在酸性pH下与pH依赖性离液序列高的离子接触。同样，P.Nishani-an等人在J.Infect.Dis.162：21-28(1990)中描述了一种用于解离分析物-抗HIV抗体免疫复合物和变性抗HIV抗体的酸水解血清样品预处理方法。但为了实现抗HIV抗体的完全变性，须用0.5N HCl溶液于37℃将试验血清处理60分钟。

虽然如上所述用酸水解法处理蛋白质或肽抗原可提供准确的结果，但总是期望能更快地获得这些结果并有更高的敏感性。再者，某些分析物不能经受如此强烈的酸水解。例如，来自某些微生物脂多糖(LPS)抗原的2-酮-3-脱氧辛酮糖酸(KDO)糖将因如此处理而被水解，从而破坏了它们的抗原活性。因此，将期望有一种免疫检测方法，其中存在于病人样品中的内源性抗体可在大于7.0的pH且最好在碱性pH下不可逆地变性，但又不影响分析物的抗原性。

预处理样品以修饰内源性抗体，进而减小或防止抗体对分析物检测的干扰，即可明显地改善分析病人样品中分析物之免疫检测法的效能。如上文所提到的，这些抗体和免疫复合物可干扰许多免疫检测法的分析物特异性结合步骤。本发明的样品预处理步骤利用了在大于7.0的pH，最好大于8.0的碱性pH下有活性的烷基化剂。本发明的烷基化剂在中性和碱性pH下有活性并且不影响分析物的抗原性。可望烷基化剂作用于抗体的赖氨酸、精氨酸或伯胺基团以修饰抗体上的这些基团，从而防止抗体干扰分析物检测，所说的烷基化剂包括但不限于戊二醛、邻位甲基异脲、甲醛、丁二酮、环己二酮和S-乙酰-巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。

在进行免疫检测之前，失活所说的烷基化剂，以使其不影响用于免疫检测的试剂。失活烷基化剂的方法根据所使用的烷基化剂而定。适用于本发明的一种类型的烷基化剂是在碱性pH下有活性而在中性pH下无活性的烷基化剂。这种类型的烷基化剂特别适用于以这样一种形式检测病人样品中存在的分析物，即需用某种碱性去污剂溶液预处理样品以提取分析物。

在一个实施方案中，于免疫检测衣原体LPS，或相似的抗原之前，用碱性去污剂进行提取，然后用烷基化剂预处理样品。应在中和样品溶液之前加入烷基化剂。在一优选的实施方案中，于碱提取后加入只在碱性pH下有活性的烷基化剂，并与样品溶液保温足够长时间，使内源性抗体受到修饰，从而使之在免疫检测期间不能干扰对分析物的检测。必须选择适当的烷基化剂，以使其与用来提取分析物的其他试剂相容。保温后，经中和样品溶液而失活烷基化剂并完成免疫检测。

在一个实施方案中，待检分析物是对酸敏感的。为本发明之目的，“酸敏感的“是指当在pH小于3.0的溶液中保温时分析物失去其抗原活性。为本申请之目的，酸敏感性分析物包括但不只限于源自砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和大肠杆菌(Escherichia coli)的具有KDO部分的的LPS抗原。

在一特别优选的实施方案中，免疫检测LPS抗原并在抗原提取步骤后，合并加入烷基化剂和二硫赤藓糖醇(DTT)。DTT是一种粘液溶解剂及用于结合半胱氨酸的化学修饰剂。结合使用DTT和烷基化剂可提高信号的长时间稳定性并增加检测法的敏感性。