[发明专利]由酶促反应制备的二聚IL-2以及用于制备该IL-2的源于神经的转谷氨酰胺酶

说明书

本发明涉及一种源于神经的新的转谷氨酰胺酶（下文中命名为TG_N）以及由哺乳动物酶促产生的二聚白细胞介素-2（IL-2），该二聚IL-2对少突神经胶质细胞有细胞毒性。本发明进一步涉及所述酶TGn以及所述具有少突神经胶质细胞细胞毒素活性的二聚IL-2的制备，以及两者用于诱导和促进哺乳动物神经再生的用途。

哺乳动物中枢神经系统（CNS）的已成熟神经在轴突损伤后极少显示有再生能力。受损的轴突可以自动生长，但在生长几百微米还没有横越受伤位点以及延伸至远侧的残余部分即已停止。这种再生障碍归因于神经周围环境的不接受特性，包括星型细胞（瘢痕形成细胞）没有能力支持生长，巨噬细胞和/或其产物的缺乏，以及抑制轴突生长的成熟少突神经胶质细胞的形成。

近来，我们证明在自发再生系统如成熟鱼视神经中，对损失的应答以及再生过程都与一种因子或几种因子的存在相关联，我们将它称为少突神经胶质细胞胞毒因子（OCF），该因子选择性地对鱼和大鼠的少突神经胶质细胞有毒（公开的欧洲申请EP  No.415321;Cohen等人，1990;Sivron等人，1991）。后来我们对该源于鱼的因子进行鉴别，其为一种类似于IL-2的分子，其分子量为28KDa，而人免疫IL-2的分子量为15KDa，源于鱼淋巴细胞的IL-2分子量为14KDa（公开的欧洲申请EP  No.501445;Eitan等人，1992）。OCF和IL-2之间分子量的差异产生了有关该因子来源的问题，即，或者它是由存在于神经中的细胞或从炎症细胞产生的原位修饰的IL-2，或者是与编码免疫IL-2的基因不同但与其具有高度同源性的基因的产物。

根据本发明现已发现，鉴别为转谷氨酰胺酶族的一个成员并且发现其在鱼而不是哺乳动物的受损伤后视神经中含量增高的一种酶在可能是通过将两个分子交联而修饰IL-2的方法中起作用，在该修饰方法中产生了在受损伤鱼视神经中观察到的类似于IL-2的高分子量物质。本文中称之为TG_N的该源于神经的新的转谷氨酰胺酶。引起IL-2的二聚化作用。从而使之对少突神经胶质细胞有胞毒性。

本发明涉及显示出少突神经胶质细胞胞毒活性的可由酶促产生的二聚IL-2。本发明进一步提供了从哺乳动物IL-2直接酶促制备具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2的手段和方法。

由于在由受损伤鱼视神经限制的培养基中早期可检测少突视神经胶质细胞毒性因子和IL-2类似物，而在完整鱼视神经限制的培养基中没有检测到（EP415321和EP501445），因而在受损伤鱼视神经中探究IL-2原位加工以及修饰为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚体形式的原理。

本发明发现了可从受损伤鱼视神经中获得转谷氨酰胺酶族的一种酶。该源于神经的转谷氨酰胺酶（TG_N）将哺乳动物IL-2转化为具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2。

因此本发明进一步涉及TG_N酶，该酶是水溶性的，由十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染色分析测定该酶分子量为约55KDa，并且在受损伤的鱼视神经中检测到该酶的含量比在完整鱼视神经中酶含量增高。用抗一种多肽的抗体将受损伤的鱼视神经的条件培养基亲和层析可以纯化TG_N。其中所说的一种多肽与转谷氨酰胺酶的保存完好的活性抗原决定基位点相对应。

本发明进一步涉及由哺乳动物包括人，酶促制备具有少突神经胶质细胞胞毒活性的二聚IL-2的方法，该方法包括将哺乳动物，包括人的IL-2与本发明的TG_N酶一起保温。

在本发明中用作为TG_N酶底物的单体IL-2包括任何种类的天然和重组IL-2，优选的是哺乳动物IL-2，最优选的是人IL-2，并且可采用常规技术，如采用Robb等人的方法（1983）制备。该单体物质优选用重组DNA技术，例如由Taniguchi et al.，1983，或Devos，R.，1983方法制备。根据本发明优选使用重组人和鼠IL-2。