[发明专利]家畜口蹄疫病毒多肽疫苗及其制备方法

说明书

本发明属遗传工程领域。

家畜口蹄疫病毒是世界烈性家畜传染病，可感染多种偶蹄类家畜，尤其对猪和牛的感染严重。家畜一旦染上此病，很快蔓延传染，病势发展甚快。目前抗口蹄疫病毒疫苗的传统制备方法是采用组织培养法繁殖口蹄疫病毒，然后将病毒灭活成为死疫苗。另一种方法是通过各种减毒方法制得弱毒疫苗。这两种疫苗虽然都有较好的免疫能力，但是制备的安全性很差，因为在它们的生产过程中需培养大量病毒，而该种病毒是空气传染，生产过程中与病毒接触过的任何工具或器皿都有散毒的危险。而且传统的灭活疫苗与病毒弱毒疫苗一旦灭活或减毒不完全，甚至自然突变都可能有极少量病毒颗粒，它们仍然有感染致病的能力。在大规模对动物的免疫过程中，可能会导致极少量被免疫动物发病而成为疾病大规模流行的病原中心与媒介。虽然目前采用基因重组方法，制备大量使用安全的抗原，但是如克隆VP1蛋白的基因制备的抗原免疫原性不强，对动物的保护效果尚不理想。

本发明的目的是发明一种能有效预防家畜口蹄疫病毒的、安全可靠的疫苗及其制备方法。

本发明是一种家畜口蹄疫病毒多肽疫苗，是编码口蹄疫病毒毒株VP1蛋白中有免疫原性的包含有20个氨基酸和14个氨基酸的DNA序列，该多肽疫苗是20个氨基酸和14个氨基酸的DNA序列串联成的编码20肽-14肽-20肽的基因，是三个免疫原性的肽段基因，介于其间的DNA连接序列共编码13个氨基酸，它的核苷酸序列是：

AATTCATGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTA

GTACCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCATGAACGAGTCTTTCAACGAGCAT

CTCTGCCACCCGGGCGTCACAAACAGAAAATCGTAGCTCCAGTAAAACAGACTCTACAAT

GAGACGGTGGGCCCGCAGTGTTTGTCTTTTAGCATCGAGGTCATTTTGTCTGAGATGTTA

TCGAGCTCGAATTCATGGTACCCTCGAGGGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTAC

AGCTCGAGCTTAAGTACCATGGGAGCTCCCATGGTTTGGACGCACCACTGGACGTCCATG

TTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTCTGCCATGAG

AACGAGTCTTTCAACGAGCATGAGACGGTACTCCTAG

该基因从5’端到3’端之间有多个限制酶切点，如EcoRI，KpnI，PstI，SmaI，SacI，EcoRI，KpnI，XhoI，KpnI，PstI，BamHI。该基因插入质粒载体的β-半乳糖苷酶基因末端的EcoRI和BamHI两个切点之间，如果插入质粒载体pWR590，则在EcoRI的5’端有来自pWR590的SacI切点，在BamHI的3’端还有来自pWR590的XbaI，SalI，PstI，HindIII切点。

根据基因插入质粒载体的大小，得到疫苗蛋白的分子量为30-140KDa。

这种家畜口蹄疫病毒多肽疫苗的制备方法包括基因重组，重组融合蛋白的制备。先用常规化学合成方法合成编码141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的小肽基因，将其串联，加入13个氨基酸连接核苷酸序列，再与质粒载体的大分子β-半乳糖苷酶基因末端连接，或者与乙肝病毒核心抗原基因连接，将此重组质粒转入细菌表达，将细菌表达的菌株置于营养丰富的培养基中发酵，发酵温度30-37℃，发酵时间9-24小时，发酵液中加入浓度为50-100ug/ml的氨苄青霉素和IPTG，发酵完毕经过离心，粉碎细胞，再离心即可。用常规的化学合成方法合成编码为141-160位氨基酸和200-213位氨基酸的小肽基因。将这两个DNA片段串联成为编码20肽-14肽-20肽的基因，然后插入质粒载体的β-半乳糖苷酶基因。插入的质粒载体可以是pWR590，也可以是pUC系列质粒。具体操作同实施例。将重组融合蛋白转入细菌表达，转入的细菌可以是大肠杆菌，或枯草杆菌，经过发酵，得到的白色沉淀即为重组融合蛋白。将该融合蛋白悬浮于尿素溶液中，经SDS-PAGE电泳检测，证明融合蛋白占50％。具体实验条件同实施例。