[发明专利]一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺

说明书

本发明为一种用基因工程技术生产人白细胞介素-2的方法，国际专利分类为CN12  15/26。

近年来发现细胞分泌一系列具有不同活性的细胞因子，其中许多因子有很强的抗病毒和抗肿瘤作用，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子等。它们有的能直接杀伤肿瘤细胞，有的能激活免疫效应细胞和诱导产生其他细胞因子，共同有效地清除肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞，起到防病和治病的作用。由于这些因子的重要生物学作用使得它们成为目前基因工程药物研究和开发的主要对象。

白细胞介素-2（IL-2）是其中最有应用开发前景的细胞因子之一。尤其是通过IL-2激活免疫细胞而用以进行的过继免疫治疗，已成为肿瘤治疗一个十分有力的手段。估计IL-2对下述方面的疾病有潜在的医疗价值：

1.通过激活LAK（Lymphokine  Activated  Killer）细胞，清除病毒感染的细胞而起到防病治病作用。如对病毒性乙型肝炎的治疗;

2.通过激活LAK细胞，清除细菌感染的细胞。如治疗麻疯病。

3.通过激活LAK及TIL（Tumor  Infitcating  Lymphocyte）细胞杀仿和清除癌变细胞。已经证实，将IL-2直接注入肿瘤组织，疗效可达50%以上（如对黑色素瘤，局部循环应用效果更好）。

4.作为免疫佐剂，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）对成年人的免疫原性较差，故无预防作用，但加入IL-2后，可大为提高其免疫原性，产生较多的抗HBs，这将有实用价值。

5.IL-2对其它免疫功能低下的疾病，如AIDS和SCID等也可能有治疗作用。

由于IL-2的实用价值，全世界有许多公司和厂家在研制生产IL-2的新方法和新工艺。鉴于遗传密码有简并性，鉴于大肠杆菌对氨基酸密码子的喜爱与人细胞的不同，本发明通过专门设计合成了能生产人天然IL-2的基因，它不改变产物人IL-2的氨基酸组成与排列顺序，而提高了基因在大肠杆菌中的表达水平。通过将一人工合成的IL-2基因组装入专门设计的，有强表达能力的载体PLy-4中，构建成IL-2表达质粒PLy-4S。它能在大肠杆菌中高表达，使IL-2占菌体总蛋白的30-40%。同时，本发明也提供了一种高效的产物IL-2的分离纯化技术。在制得纯净的包涵体后，只用一步Sephacryl S-200柱层杆就可获得纯度＞95%，比活达2×10⁶单位/毫克蛋白的IL-2。产品经PAGE及HPLC分析验证，N未端15个氨基酸顺序分析均证明它与天然IL-2相同。生物功能测定与天然IL-2一样。因此，本发明具有大规模生产的意义。

本发明的示意图说明如下：

图1，合成设计的人IL-2基因及其相应的氨基酸顺序。

图2，合成的IL-20个小片段的顺序。

图3，IL-2基因大片段合成及完整基因组装示意图。

图4，合成的IL-2基因序列测定。

图5，完整IL-2基因组装过程。

图6，IL-2表达质粒的构建。

图7，IL-2表达质粒的酸切鉴定。

1.λDNA标准Ⅲ（EcoRI+HindⅢ）

2.EcoRI+BamⅢ酶切

3.BamHI+ScaLI酶切

4.BgLⅡ+EcoRI酶切

图8，温度诱导表达IL-2。

图中：30，42分别代表30℃，42℃培养。

图9，图8的黑度扫描。

图10，包涵体分离的结果。

图11，Sephacvye  S-200分离IL-2。

图12，IL-2的电泳鉴定。

图13，还原型IL-2的HPLC鉴。

图14，氧化型IL-2的HPLC鉴定。

图15，IL-2对维持CTLC-2的细胞生长的作用。

图16，IL-2单抗体IL-2生物功能的抑制作用。

图17，IL-2活化LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

通过下述实施例对本发明的技术特征作详细描述。

实施例1：

材料与方法。

（1）限制性内切酶、T₄DNA聚合酶、T₄DNA连接酶、CIP碱性磷酸酯酶、DNA聚合酶I Klenow片段和DNA分子量标准Ⅲ、Ⅴ均购自Boehringer公司和Biolabs公司。

（2）菌种与质粒。JM101、103和105，BMH71-18  K802为本实验室保存;JF1125由刘爱萍赠予;PRC23由Crowl赠予;PTZ-12、PLR-1由本实验室构建。