[发明专利]一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺

权利要求书

1、一种人白细胞介素-2(IL-2)基因的合成，表达质粒的构建及产物的生产工艺，其特征是：

a.使用人工设计、化学合成的基因，基因结构式如下：

GA  ATT  CTT  ATG  GCT  CCG  ACT  TCT  TCT  TCT  ACT  AAA  AAG  ACT  CAG

Met  Ala  Pro  Thr  Ser  Ser  Ser  Thr  Lys  Lys  Thr  Gln

CTT  CAG  CTG  GAA  CAT  CTG  CTG  CTG  GAC  CTC  CAG  ATG  ATC  CTG  AAC

Leu  Gln  Leu  Glu  His  Leu  Leu  Leu  Asp  Leu  Gln  Met  Ile  Leu  Asn

GGT  ATC  AAC  AAC  TAC  AAA  AAC  CCG  AAA  CTG  ACC  CGT  ATG  CTG  ACC

Gly  Ile  Asn  Asn  Tyr  Lys  Asn  Pro  Lys  Leu  Thr  Arg  Met  Leu  Thr

TTC  AAA  TTC  TAC  ATG  CCG  AAA  AAA  GCT  ACC  GAA  CTG  AAA  CAT  CTG

Phe  Lys  Phe  Tyr  Met  Pro  Lys  Lys  Ala  Thr  Glu  Leu  Lys  His  Leu

CAG  TGC  CTT  GAA  GAA  GAA  CTG  AAA  CCG  CTG  GAA  GAA  GTT  CTG  AAC

Gln  Cys  Leu  Glu  Glu  Glu  Leu  Lys  Pro  Leu  Glu  Glu  Val  Leu  Asn

CTG  GCT  CAG  TCT  AAA  AAC  TTC  CAT  CTG  CGT  CCG  CGT  GAC  CTG  ATC

Leu  Ala  Gln  Ser  Lys  Asn  Phe  His  Leu  Are  Pro  Are  Asp  Leu  Ile

TCT  AAC  ATC  AAC  GTT  ATC  GTT  CTG  GAA  CTG  AAA  GGT  TCT  GAA  ACC

Ser  Asn  Ile  Asn  Val  Ile  Val  Leu  Glu  Leu  Lys  Gly  Ser  Glu  Thr

ACC  TTC  ATG  TGC  GAA  TAC  GCT  GAC  GAA  ACC  GCT  ACC  ATC  GTT  GAG

Thr  Phe  Met  Cys  Glu  Tyr  Ala  Asp  Glu  Thr  Ala  Thr  Ile  Val  Glu

TTC  CTG  AAC  CGT  TGG  ATC  ACC  TTC  TGC  CAG  TCT  ATC  ATC  GTT  GAG  Thr  Phe  Met  Glu  Tyr  Asp  GLu  Thr  llEVal    Glu  TTC  GTG  AAC  GGT  TGG  ATC  ACC  TTC  TCC  CAGTCT  TCT  ACC  Phe  Leu  Asn  Arg  Trp  lle  Phe  Cys  GlnSer  lle  Ser  Thr  GTG  ACC  TGA  TAG  GAT  CC

Leu  Thr  TermTerm

IL-2由133个氨基酸组成，合成的该基因有399bp，加上起始密码子ATG，终止密码子TAG和TGA及5′和3′，末端克隆用的限制性内切酶切点，共有426  bp，选用了大肠杆菌使用频率高的密码子，使合成的il-2基因能在大肠杆菌中高效表达，产生大量的人Il-2，而不改变IL-2的氨基酸顺序；

(b)将合成的IL-2基因克隆入带有P_l启动子Cl t857温控阻遏蛋的基因、核糖体t₁t₂5SrRNA终止信号和MCS区的基因载体PLy4后，构建成IL-2的表达质粒Ply4-Syn IL-2，转化大肠杆菌后获得高效表达；

(c)表达产物以包涵体的形成存在，得包涵体产物后用8M盐酸胍溶解，上Sephacryl S-200柱，一步柱层析可以得到纯度＞95%，经活＞2×10⁶国际单位/毫克的IL-2。

2、根据要求1所述的IL-2表达质粒的构建，其特征是使用了表达载体PLy-4，它是由P_L强启动子、CIts857温度敏感的P_L启动子阻遏蛋白基因，这个基因与P_L启动子相连的片段是用Pst和BglⅡ两个限制性内切酶组装入质粒的，易于切出，SD顺序与起始密码子之间有AATTC5个碱基距离和在插入基因的3'末端的转录终止信号t₁t₂（来自5SRNA基因），以上结构使PLy-4载体成为一个高效表达载体。