[发明专利]酶法生产没食子酸的工艺

说明书

本发明涉及使用酶的方法来制取芳环化合物衍生物的技术，具体而言，涉及酶法生产没食子酸的工艺。

没食子酸又名倍酸、五倍子酸(gallic acid)，化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸(3，4，5-trihydroxy benzoic acid)，分子式为(OH)₃C₆H₂COOH·H₂O，结构式为：分子量188.14，白色针状结晶，是一种用途广泛的精细化工产品。工业上常用五倍子(chinese nut galls)或塔拉(tara，刺云实)为原料，通过化学水解法或微生物发酵法制取没食子酸。其中，化学水解法是以强酸或强碱为催化剂，使五倍子单宁水解生成没食子酸。然后，经过过滤、浓缩、脱色、干燥等一系列化工过程制得产品。

使用硫酸水解法，由于浓硫酸具有强氧化性，在反应过程中会破坏单宁中的一部份苯环结构，而且有副反应；因此，水解转化率仅85％，总收率为69％，原料未充分利用，产品经济效益不高。

用碱水解法(CN1057255A)产品收率比酸水解法高，但须使用大量的碱作为催化剂，而后又用硫酸中和反应产物。用五倍子作原料的碱法工艺(U.S.Patent 2723992.1955)，需使用大量有机溶剂进行萃取分离，再经过溶剂回收、脱色、干燥等过程得到产品。溶剂萃取法设备投资大，有机溶剂成本高，溶剂萃取及回收技术复杂，在国内不宜采用。

微生物发酵法(CN87103987)的原理是利用微生物在含单宁的水溶液中进行发酵，以单宁酸水解后的葡萄糖作为碳源，供微生物生长、繁殖，与此同时微生物在溶液中经诱导产生酶，单宁又经酶的催化水解作用生成没食子酸。这种方法的生产周期长，水解不完全，发酵结束后还有15％～20％单宁未水解转化。

本发明的目的是提供一种克服上述缺点的没食子酸生产工艺，用以提高产品收率，降低原料单耗，简化工艺流程，经济、合理地利用植物单宁资源。

长期的科研与生产实践早已证明：很多种霉菌在一定条件下与诱导物作用都能生成单宁酶(tannase)，其中，以黑曲霉菌使用得最多、最成熟，已经有一百多年的应用历史。单宁酶又称单宁乙酰基水解酶(tannin acyl enzyme)，属于孢外诱导酶(induced enzyme)，是一种具有水解催化性能的生物催化剂。在适宜条件下，它能专一、高效、定向裂解单宁中的酯键、糖苷键和缩酚键水解生成没食子酸。

人们经过多年的生产实践和研究(Agr.Biol.Chem.，Vol.32.No.7，P.803～809，1968)，发现生成单宁酶的最佳条件与酶水解单宁的最佳条件，包括温度、pH值、溶氧量、诱导物浓度、培养基成分等，大部份不相同。在一般发酵法生产工艺中，单宁酶的生成和水解单宁的反应，都是在同一个反应器(发酵罐)中进行。由于两个反应要求的最佳条件不同，在发酵过程中，总是顾此失彼、相互制约，两者都不能达到最佳反应状态。这就是导致单宁水解不完全的主要原因。

为解决发酵法工艺中的这一难题，发明人提出的解决方案是：将发酵制酶与水解制酸两个反应分别用两个容器相对地分开进行，使二者都达到最佳状态。这样，单宁水解转化率可达98％以上，已经接近或达到定量转化。必须说明，制酶和制酸二者既有区别，又有联系，相辅相成，各有所侧重，并不是绝对的划分。在制酶过程中，以生成大量含酶菌丝球为主，与此同时也培养出大量健壮黑曲霉孢子；在制酸过程中以水解单宁为主，同时又继续进行发酵，产生一部份酶，促使单宁完全水解，因此也同样需要供给足够的溶解氧。

在发酵制酶过程中，各项发酵参数及培养基的配比十分重要，必须严格控制。适宜温度为27～33℃，最适温度为30℃；起始pH值为5～6.5，反应过程中加碱调节在pH3～5之间，以pH3.5～4.5为最好；溶氧量控制在3.5～5.0gO₂/L·h之间。采用黑曲霉No.316(aspergillus neiger No.316)作为产酶菌种。

制酶培养基中，C/N比为5～15，单宁浓度为1％～8％；单宁以外碳源加入量为单宁量的0.3～1倍。外加碳源包括蔗糖、葡萄糖、蜂糖等均可使用；外加氮源可以用任何无机铵盐或硝酸盐，如硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等均可使用。培养基中还应有少量的硫、磷、钾、钠、锌、镁的无机盐和酵母膏或维B族化合物作为营养添加剂。