[发明专利]提高产2-酮-L-古龙酸混合细菌转化活力的方法

说明书

本发明为一种能强化从山梨糖生产2-酮-L-古龙酸（简写2-KGA）混合细菌活力的菌种选育方法和保藏方法，使菌种保持在高活力水平，适合工业生产应用。

现用的生产维生素C前体2-KGA的混合细菌发酵是我国首先应用于工业生产的（尹光琳等：微生物学报20（3）.P246、1980）。长期以来，由于缺乏对混合菌种的选育和保藏方法，所以转化率不高，生产不稳定，菌种不易保藏。本发明的主要内容为提供一高活力菌株，使培养物更有效地产生2-KGA。并建立方法使获得的混合菌株在使用上方便、性能稳定，可长时间保藏，不降低活力。

本发明是经过以下过程实现的：首先搞清混合菌中两个菌的相互关系，其中氧化葡萄糖酸杆菌（简称小菌）是产生2-KGA的主要菌，它依靠伴生菌（芽胞杆菌或其它菌、简称大菌）才能良好的产生2-KGA。提高小菌的产酸能力是提高转化率的关键。经研究发现两菌之间除存在着互生关系外，还有拮抗关系，其拮抗程度随所用的不同大菌而不同。拮抗性大的，小菌生长弱，但活力高。我们利用不良因子激发并提高小菌产酸能力，如通气不足，贫乏培养基，与拮抗性大的伴生菌长时间冷冻保存，以及使用生物抑制剂（2，4-二硝基苯酚及二价铜离子）等手段对小菌进行处理。处理后的小菌生长减弱，但可通过复壮恢复生长。

其复壮办法为：在固体培养基中加入预先培养好的大菌菌液（含玉米浆成份），使小菌菌落变大，菌形粗壮。而后进行单菌落筛选，选取高活力的小菌菌株。用冷冻干燥法保藏。高活力小菌必须与拮抗大的伴生菌共存，才可以使菌株在长时间内保持活力不变。

实例：

一、培养基的组成（%）（每100毫升培养基所用克数）

混合细菌在以下培养基分离、培养复壮和检查活力。

1、斜面固体培养基（包括分离用培养基）

A培养基：山梨糖0.5;牛肉膏0.3;酵母膏0.3;蛋白胨1.0;MgSO₄0.2;洋菜2.0;pH7.0-7.2。

B培养基：加入预先培养好的大菌清液（含玉米浆成份），其它同上。

2、种子液体培养基组成（%）：

玉米浆1.0;山梨糖1.0;脲0.2;CaCO₃0.1;pH6.4-6.7。

3、摇瓶发酵培养基组成（%）：

山梨糖7-8;玉米浆1.0;脲1.2;pH6.4-6.7。

二、处理过程（EP130强化小菌的获得）：

混合细菌→B培地分离→E小菌

三、强化后菌种活力情况

原菌种  强化菌种

纯小菌生长  只在B培地生长  A培地亦长

纯小菌生长时间  3天  2天

纯小菌转化活力  2-3g/l  26.18g/l

(基质浓度50g/l)

混菌效果  58-65g/l  68-75g/l

(基质浓度70-80g/l)

混菌斜面保存时间  超过一个月活力  四个月活力不降

(冰箱4℃)  下降80%以上

转化能力稳定性  不稳定  稳定

结果证明，经处理后纯小菌活力提高为原来的5-10倍，混菌转化能力比原水平提高5-10%，冷冻管经保存五年活力不降。