[发明专利]人胰岛素类似物的制备方法

说明书

本发明涉及新的在溶液中结合能力低的人胰岛素类似物、制备这种胰岛素类似物的方法、含有本发明人胰岛素类似物的胰岛素制剂和使用这种人胰岛素类似物治疗糖尿病的方法。

自从1922年发现胰岛素以来，已有许多不同种类的胰岛素制剂用于治疗糖尿病。最初仅仅使用快速产生并且较快失去胰岛素活性的胰岛素溶液，但是后来通过加入例如锌盐和/或鱼精蛋白降低胰岛素溶解度，制备了具有广泛活性的胰岛素制剂。由于生物利用度的原因，所用胰岛素通常是从家畜（大多数为牛、猪和羊）胰腺中回收得到的，但是最近含有通过生物技术方法得到的人胰岛素制剂也见诸于市。

人胰岛素的结构图示于下：

B-链（续）

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

25        26        27        28        29        30

由某些家畜得到的胰岛素，其结构与人胰岛素非常相似，狗和猪的胰岛素与人胰岛素的区别仅在于在B链的30位上含有Ala，免胰岛素的区别仅在于在同一位置上含有Ser。按Morihara等（Nature        280，1979，412-413）和Marcussen（美国专利US-4343898）所述半合成法，用Thr取代B30氨基酸残基，上述这些胰岛素可转变为人胰岛素。

在生理pH值条件下，溶解这种胰岛素时，在单体、二聚体、四聚体、六聚体的以及甚至多聚体胰岛素之间，就能建立依赖浓度结合的平衡。这种平衡例如可以通过超速离心、渗透压测定或凝胶过滤等方法（参阅R.Valdes        Jr.and        G.A.Ackers，Methods        in        Enzymology，Vol.61.Enzyme        Structure，Part        H.eds.：Hirs        &        Timasheff，AcademicPress        1979，pp.125-142）予以测定。在一般的胰岛素制剂的配制中，这种平衡以胰岛素向很高程度变动时，即形成六聚体。

胰岛素分子中的取代目的在于提高胰岛素在治疗糖尿病中的活性。已经公开的国际专利申请No.WO        86/05497公开了通过中性氨基酸残基一次或多次取代胰岛素分子中的Glu就会使胰岛素的沉淀区以注射后迟缓释放的方式发生移动。

此外，业已公开的欧洲专利申请No.EP        214826公开了在注射后被特别迅速地吸收的胰岛素类似物。这种效应是由于在胰岛素分子中，尤其是在B9-B12区和B26-B28位上某些取代抑制了胰岛素的结合趋势，从而使其基本上以单体或二聚体形式存在。但是，许多这种胰岛素类似物都显示其生物活性的降低。

近几年来已经介绍了大量人工制备的人胰岛素类似物，一般都是阐明结构对活性的影响（参阅Marke        et        al.，Hoppe-Seyler′s        Z.Physiol.Chem.，360，1979，1619-1632）。胰岛素（B22-B26）顺序中的取代对受体结合的影响更具有特殊的意义，例如所述顺序被认为是胰岛素受体结合的基本位点，又如在所述位点上的取代能够发生突变（参阅S.Shoelson        et.al.：Biomed.Res.5（3），1984，267-272）。业已发现，取代了phe（B24）或phe（B25）的类似物，其生物活性很低，因此可以断定，这两个氨基酸的存在对受体结合具有决定性的重要意义。

本发明是以下述公认的知识为基础，即不具有（phe^B24）或（phe^B25）氨基酸残基的某些人胰岛素类似物在溶液中结合趋势较低，同时在体外的生物活性不变或甚至更高于人胰岛素。（Phe^B24）或（Phe^B25）的缺失，其作用在于（Lys^B29）转移到（Lys^B28）中。在人胰岛素分子的该位置上，正电荷的位置被认为是本发明的重要方面。

因此，就其最重要方面而言，本发明涉及带正电荷氨基酸残基的人胰岛素类似物，所述氨基酸残基就是B28位上的Lys或Arg，即由（Gly^B20）起的B链中的第8位。