[发明专利]嘧啶类似物抗性基因DNA及其应用

说明书

本发明涉及含嘧啶类似物抗性基团的DNA，掺有该DNA的质粒，由该质粒转化的埃希氏菌属和芽胞杆菌属的微生物，以及利用所述微生物制备尿嘧啶和/或尿苷的方法。

尿嘧啶和尿苷均用作生化试剂或药物合成中的起始物质。但是，野生菌株只能产生少量的细胞外的尿嘧啶和/或尿苷，因此，为了通过发酵生产尿嘧啶和/或尿苷，要采用人工突变法，即，诱导野生菌株突变，使其具有产生尿嘧啶和/或尿苷的能力。常用的发酵生产法包括采用由单孢丝菌属微生物而得到嘧啶类似物抗性菌株的方法（日本专利公开18873/1982），采用由短颈细菌属细菌而得的抗嘌呤类似物菌株的方法（日本专利公开30476/1982），和采用由芽胞杆菌属微生物而得的缺乏尿苷核苷酸磷酰化酶活性并具有耐嘧啶类似物作用的菌株的方法（欧洲专利申请-A2-0179468）。

就改善尿嘧啶和/或尿苷的产体而言，上述方法均为已知。但是，的确还没有一种方便的诱变处理方法能够通过选择放大特异基因来增加收率。

本发明者十分深入地研究了利用基因重组技术繁殖尿嘧啶和/或尿苷产体的方法，并发现：用掺有抗嘧啶类似物基因的质粒转化埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属微生物得到的菌株能够提高培养基中的尿嘧啶和/或尿苷产量。以这一发现为基础，本发明作了更深入的研究，进而完成了本发明。

因此，本发明的目的之一是提供尿嘧啶和/或尿苷产体，该产体可以以更高的产率产生这些物质。

本发明的目的之二是提供一种利用产体生产尿嘧啶和/或尿苷的方法。

根据下文描述及参照附图，对本领域普通工作人员而言，本发明的上述目的和其他目的及优点是明显的。

图1是按照下文实施例1所得的重组质粒pYRC100的限制酶图。括弧中的数字代表千碱基对（kb）数目。H代表HindⅢ卵裂位点，p代表PstⅠ卵裂位点，E代表EcoRI卵裂位点。

根据本发明，提供了下述DNA，掺入该DNA的质粒，用该质粒转化的微生物，和利用该微生物生产尿嘧啶和/或尿苷的方法。

（1）具有嘧啶类似物抗性基团的DNA。

（2）上述（1）中限定的DNA，该DNA具有多个PstⅠ卵裂点（彼此相距10kb），并且在该PstⅠ片段中有2个EcoRI限制位点和8个HindⅢ限制位点。

（3）上述（1）或（2）限定的DNA，该DNA由芽胞杆菌属微生物的染色体DNA获得，该微生物对嘧啶类似物具有抗性，并且能够产生尿嘧啶和/或尿苷。

（4）掺有上述（3）所限定DNA的质粒。

（5）由上述（4）限定的质粒转化的埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属微生物的纯净培养物。

（6）一种生产尿嘧啶和/或尿苷的方法，该方法包括在培养基中培养下述埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属微生物，该微生物经掺有嘧啶类似物抗性基因的质粒转化，所述基因从对嘧啶类似物有抗性的芽胞杆菌属微生物的染色体DNA中获得，由此使得在培养汤中形成并累积尿嘧啶和/或尿苷，并从所述培养汤中回收尿嘧啶和/或尿苷。

从嘧啶类似物抗性微生物中获得本发明的DNA。

在本说明书中，术语“嘧啶类似物抗性菌株”意指下述微生物，即以埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属作为母体菌株衍生出的微生物，并且其遗传特性已发生了改变即它们能够在含有一定浓度的一种或多种嘧啶类似物的培养基中生长，而在这样的高浓度下其母体菌株却不能在该培养基中生长。术语“嘧啶类似物”意指峁股嫌豚奏ぜ罾嗨频奈镏剩纾蜞奏ず桶奏ぃ纾?-氮杂尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，2-硫胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，及其核苷和核苷酸。只要对至少一个嘧啶类似物有抗性，任何嘧啶类似物抗性菌株均可用于本发明。

这类DNA供体的实例包括能产生尿嘧啶和/或尿苷的芽胞杆菌属细菌。具体的实例为枯草杆菌AA47（IFO    14705，FERM    p-9866）。

用于制备含嘧啶类似物抗性基因DNA片段的方法实例包括下述方法，即采用Saito和Miura所述方法从该供体中提取染色体DNA〔H.Saito    and    K.Miura，Biochimica    et    Biophysica    Acta，72，619（1963）〕，然后用限制酶PstⅠ将其分裂之。然后将由此得到的含嘧啶类似物抗性基因的染色体DNA片段插入载体DNA中。