[发明专利]提取超氧化物歧化酶复合物的方法

说明书

本发明涉及一种用于从人和多种动物血液中提取超氧化物歧化酶复合物的工艺流程和操作方法。

超氧化物歧化酶（Superoxide    Dismutase，以下简称SOD）广泛存在于人和多种动物血液和组织中，自1969年被发现以来，已被提取药用。从SOD清除人体中超氧自由基的机理来看，它还需要过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）协同作用。我们把同时含有SOD和CAT、GSHPx的复合物称作SOD复合物、动物实验表明，SOD复合物抗衰老的治疗效果较单纯SOD要好。而国内外现有提取SOD的方法，如异丙醇沉淀法;铜盐沉淀杂蛋白、离子交换法和超浓缩、凝胶过滤法;乙醇-三氯甲烷沉淀法等，在提取过程中去除和破坏了CAT和GSHPx。因此，需要一种从血液中提取SOD复合物的方法。我国《医药工业》杂志1983.（4）：4和1985.（16）：9介绍的提取SOD纯酶的方法，其中间产品也不是SOD复合物。经对1964-1988年世界专利文献（WPI）和非专利文献（GAR）检索、Methodsen    Enzymolog    1978.108（1）：51等文介绍了多种提取SOD纯酶的方法，但未见有提取SOD复合物方法的介绍。

本发明的任务，是提供一种从人和动物血液中提取SOD复合物的方法。其提取物同时含有SOD和CAT、GSHPx，使SOD的总活力损失少，并且保留多种小分子抗氧剂（如硒、胱氨酸、半胱氨酸）以及多种维生素、微量元素、氨基酸等。这种SOD复合物不仅可作药用，还可用于多种食品和化妆品作添加剂。其生产周期短，操作相对简便。可广泛用于工业生产，禽类、肉食加工厂都可采用。同时，因为加工处理了原来被废弃的血液，可减少环境污染。

按本发明这一任务可以用以下方法来解决：

2.生产流程1所用的抗凝剂如用无水枸橼酸钠配制，浓度为3.13%;如用含2分子结晶水的枸橼酸钠配制，浓度为3.8%。使用前均应调整酸硷度至PH6.4-7.6。

3.生产流程2所用的氯化钠溶液浓度为2%-5%，而不是0.9%氯化钠溶液。

4.生产流程3所用的去离子水应当预冷;与血细胞混合后置于-5℃-0℃冷藏箱中过夜，使血细胞完全溶胀破裂，以提高SOD复合物的产品质量和得率。

5.生产流程4加用预冷乙醇和三氯甲烷时，按体积比例分别加入，边加入边剧烈搅拌。如加入速度过快使局部浓度过高，会造成酶的失活和其它蛋白质变性。应于投料前启动电动搅拌机。搅拌时间和速度要足够，防止团状或粗颗粒状物形成。

6.生产流程5的减压蒸馏去除抽提液中的乙醇和三氯甲烷，条件为，抽提速率为0.8-1.2升/秒，蒸馏温度为30℃-45℃，持续2-4小时。

7.生产流程6所用的丙酮预冷至-15℃--20℃，缓慢加入抽提液中。

8.全部提取过程中，提取液的温度除专作调整的环节外，控制在10℃以下。如能控制在0℃左右，则更好。

9.全部提取过程中，提取液的酸硷度除专作调整的环节外，控制在PH6-9。

10.生产流程9加乙醚抽干时，搅拌时间1分钟左右。抽干速度，如以1升真空瓶计，抽气速度为0.5升/秒-1.0升/秒，极限真空为5×10^-4托。

11.生产流程4、7、8、9加入有机溶剂后的离心，使用冷冻离心机。离心罐内的温度为-5℃-0℃。离心时间为2-4分钟，转速为1500转/分-2500转/分。

一.生产流程

1.采取血细胞。取新鲜人或动物血液，加抗凝剂，在0℃-4℃静置过夜，弃去血浆，保留沉淀的血细胞。

2.洗涤血细胞。加入2-5倍的2%氯化钠溶液，混匀，成血细胞悬液，以1500转/分-3500转/分离心后弃去上清液。再重复一次加氯化钠溶液、离心、弃上清液的过程，成为干净的血细胞。（包括红细胞、白细胞、血小板）

3.溶血。加去离子水，搅拌，冷藏过夜（或8-10小时），使血细胞溶胀破裂。

4.去除血红蛋白。加乙醇和三氯甲烷，并剧烈搅拌，之后离心，弃沉淀，取其上清液过滤，为淡黄色液体，加盐酸，调酸硷度至SOD等电点（PH5.6-6.8）附近，计量体积，置-5℃-0℃冰箱中保存备用。

5.去乙醇和三氯甲烷。将生产流程4制备的抽提液置于减压蒸馏器中，加热至30℃-45℃，同时用真空泵减压，得到不含乙醇和三氯甲烷的SOD复合物抽提液。将此液用超滤器进行浓缩，得到SOD复合物浓缩抽提液，然后用4N盐酸调整酸硷度至SOD等电点（PH5.6-6.8）附近。