[发明专利]抗促卵泡激素单克隆抗体及其制备和使用

说明书

本发明涉及单克隆抗体及其制备和使用方法。

促卵泡激素（FSH或follitropin）是由垂体分泌的一种糖蛋白激素。FSH及其它垂体糖蛋白激素（促黄体激素LH，促甲状腺素TSH）均由α亚基和β亚基构成，这些激素的α亚基是相同的，而β亚基却是不同的，它决定着各激素的特异性。

FSH与雄性动物和雌性动物的性功能有关，就雄性动物而言，FSH最重要的作用似乎是与精子成熟和营养有关，而对雌性动物来说，FSH起着促进卵发育和排卵的作用。在胚胎转移过程中，外源性FSH可用于加速排卵，或增加排卵，以得到更高的生殖力。然而，治疗动物的应答变化可能是主要问题，应答变化可能是因为批料变化和在FSH中存在污染物，尤其是有其它垂体糖蛋白激素、LH（促黄体激素）存在之故。

现有技术中，提取羊FSH（oFSH）已知的主要方法包括：

（ⅰ）利用乙醇和酸沉淀，由羔羊垂体腺制备oFSH粗提物（Sherwood，et    al（1970）J.Biol    Chem.245：2329-2336），

（ⅱ）硫酸铵沉淀（Reichcrt，L.E.in    Methods    in    Enzymology    Vol.xxxvll    Fd.O′Malley    B.W.and    Hardman    J.G.Academic    Press    Inc.N.Y.1975）。

按照该方法，通过分批加入冷乙醇或硫酸铵，沉淀出不需要的蛋白质。最后一次加入的乙醇或硫酸铵沉淀出活性组分及污染物。这些方法生产出含0.5-1.0iu/mg粗蛋白的FSH粗提物。

用垂体粗提物进一步提纯的步骤包括凝胶过滤和离子交换层析（Sherwood，et    al，1970，Sairam    1979，Grinecti    1974），得到的纯化产品的效能为每mg总蛋白含110至188单位FSH。

但是这些方法带来大量花费，浪费时间而且从每个垂体腺中提取的产品量也很少，其结果难以大量满足兽医的使用，尤其是具有稳定效能的FSH。

因此，本发明的目的是克服或至少是减轻现有技术中诸多难点之一或几个难点。

因此，本发明首先提供一种抗促卵泡激素（FSH）的单克隆抗体的制备方法，该方法包括：

提供能产生抗FSH抗体的B细胞和骨髓瘤细胞;

使B细胞与骨髓瘤细胞融合;

并繁殖生成的杂种瘤细胞。

根据本发明制备单克隆抗体的方法还包括采集所述杂种瘤细胞产生的抗体。

能产生抗FSH抗体的B细胞可选自试验动物的脾细胞和淋巴细胞。该试验动物可以是小鼠、大鼠等。该B细胞可从用FSH免疫的动物或从其致免疫的组织中获得。BALB/C小鼠是最佳免疫动物。一次或多次免疫的动物可用作产生淋巴细胞或脾细胞的抗体源。最佳方法是用多次免疫的鼠的细胞用来制备融合细胞杂种。

骨髓瘤细胞可以是任何适宜的类型。现有技术中，众所周知的从淋巴细胞瘤中形成的专门骨髓瘤细胞系，已用于产生杂种瘤的融合过程。

有几个骨髓瘤细胞系可用来制备融合的细胞杂种，其中包括P3/x63-Ag8，NS-I型骨髓瘤细胞，例如P3/NSI/1-Ag4-1，Sp2/O-Ag14和S194/5XXO·BU·1。在本发明的实例中，NS-I型骨髓瘤细胞（取自BALB/C小鼠）是最佳细胞系。

为了产生抗体的脾细胞或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂种细胞，按照本发明的融合步骤包括将体细胞与骨髓瘤细胞混合，混合比例大约为20∶1至1∶1，以10∶1为最佳。在能促进细胞膜融合的一种或数种试剂存在下，进行融合。理想的是将同类动物用作融合过程中使用的体细胞和骨髓瘤细胞源。所用的促融合剂可包括仙台（Sendai）病毒或聚乙二醇（PEG）。

因为融合方法在很低频率（例如当脾用作体细胞源时，大约每2×10⁵个脾细胞只得到1个杂种）下产生能活的杂种细胞，所以最好有一种能从未融合细胞中尤其是未融合的骨髓瘤细胞中选出融合的细胞杂种的方法。在其它产生融合的细胞杂种中，一种测定所需的能产生抗体的杂种瘤的方法也是必需的。