[发明专利]偶联到高分子量的聚亚烷基二醇类上的超氧物歧化酶的结合物的制备方法

说明书

本发明目的在于超氧物歧化酶（SOD）结合物或加合物，在这些化合物中至少有一部份SOD氨基、羧基、或巯基偶联到聚亚烷基二醇（PAG）如聚乙二醇（PEG）或聚亚乙基-聚亚丙基二醇共聚物上，其中PAG的分子量大于20，000，而理想的平均分子量为40，000至1，000，000道尔顿。除了另有说明外，PAG的分子量是用PEG作为标准通过高效筛析液体色谱法（HPLC）确定的。较好的PAG是平均分子量大于40，000至小于200，000，特别好的PAG是平均分子量为50，000-150，000。这些PAG可以是无支链的或有支链的而且可以是未被取代的或被C_1-4烷基取代的。

可防止连接到两个SOD分子上的特别有价值的PAG分子是在其分子中的一个末端基团是C_1-4烷基醚基团如异丙氧基基团。

以前的工作者已经利用低分子量（通常约为5，000和5000以下）的PEG或甲氧基-PEG连接到超氧物歧化酶（SOD）和其他蛋白质上，以得到表现出不同程度的（a）增加血清耐久性和（b）降低免疫原性的加合物。但是，对于要求充分的达到（a）及（b）的两个目的的带有低分子量的PEG或甲氧基-PEG的蛋白质基团的修饰幅度，常常导致酶活性或生物活性实质上丧失。

超氧物歧化酶是一种承担催化超氧化物基转化为氧和过氧化氢的作用的细胞内酶。提供一种较体内的天然SOD蛋质耐久的产物并延缓由于肾脏所造成的失活是本发明的一个目的。特别重要的是产品在显示低水平免疫原性的同时能保持酶活性。

正如在用小鼠做通常的导入角叉菜胶的瓜浮肿试验中所证明的此种结合物还具有一种抗炎活性。

在本发明中体现的新概念，应用了分子量大于20，000的高分子量PAG链。用于本发明的PAG可以是任何水溶性的烯化氧聚合物，例如聚（环氧乙烷）或环氧乙烷和1，2-环氧丙烷的某些共聚物。PAG可以是线型的或有支链的并可在一个或多个羟基位上被C_1-4烷氧基或其他的化学基团所取代。但是，在本发明中用于制备结合物的PAG聚合物的分子量大于20，000而较好是在40，000至200，000分子量的范围。应用分子量大于200，000的聚合物也是可能的，但是由于它们在被切削时易于断裂和它们有较高的粘度所以它们并不是较好的。

本发明的PAG-SOD加合物的分子量（相对于已知分子量的PEG标准）范围约从85，000至约2，000，000道尔顿，而较好是约90，000至1，000，000道尔顿。再者，本发明的PAG-SOD加合物和其他的PAG-加合物通常保持天然蛋白质的大部份酶活性（注：在本说明书中分子量是根据已知分子量的PEG标准决定的，为了校正高效液体色谱法（HPLC），蛋白质当量，即根据已知分子量的蛋白质标准决定的分子量，可以认为是约高5至8倍）。

本发明的结合物是一种超过以前的产品的改进产品，在产品中由于连接的PAG链较少，使活性母分子仅有较少的化学改性，因而保留了较多的母分子原有的特性。因此，正如在本发明中那样，应用较少链的高分子量PAG，加合物保留多数（如果不是大多数的话）的母分子的活性，同时也显示出增加在血流中的耐久性。本发明的加合物的另一个优点是，应用高分子的PAG，可制成由其他工作者所制成的具有同样改性程度的较大的加合物。再者，在某些应用中，较大的PAG加合物是明显地有利的。例如，用本发明的方法应用分子量为30，000-130，000范围的PEG-链制备的而且说明了本发明的原理的本发明的PEG-SOD加合物，在小鼠体内的血清半衰期约为36小时，比以前的工作者所叙述的PEG-SOD加合物较为大而长。

在PAG-SOD加合中较好是含有每个蛋白质分子上连有1至10个PAG链，而每个蛋白质分子较好是连有2至8个PAG链，而以连有2至6个PAG链最好。

当应用长链时，则达到满意的血清耐久性所需的链的数目可降低。

本发明的SOD制剂通常是由牛，其他动物（如羊、马、猪、狗、兔、鸡）或人类细胞衍生而来的以哺乳动物的含铜和含锌的超氧物歧化酶形式的酶。含其他金属离子如铁或锰的SOD制剂同样是有效的。从微生物的培养物衍生而来具有异系同基因结构的酶也是有效的（在这样的培养物中已克隆和表达了这种结构）。因为，本发明的产物已降低了致免疫性，所以由于在这些微生物培养物中转译的不保真性的结果，SOD还可能是不等同于天然存在的蛋白质。