[发明专利]在原核微生物的染色体DNA中进行稳定的基因放大

说明书

本发明涉及基因工程技术以及以该技术在原核微生物中进行DNA的染色体放大方面的应用。本发明特别涉及通过基因工程获得原核微生物的方法，而所说微生物的染色体中整合了一个以上有确定之DNA序列的拷贝，且能在其中稳定地保留。

重组DNA技术在生产蛋白质中的工业应用，关键是要得到克隆基因的高水平地稳定表达。文献中已充分介绍过以基因工程手段在某些原核和真核微生物中，获得同源或异源基因之高水平表达的几种方法。

达到基因之高水平表达的方法之一是提供具有有效调节序列的基因。另一种方法——常常与第一种方法结合使用，则是增加所需基因的拷贝数。放大作用大多是通过将基因插入多拷贝染色体外DNA分子(如质粒)中达到的。使用质粒作为所说载体分子来表达和放大遗传信息的缺点在于它们的不稳定性。

不稳定性表现有两种形式：(1)结构不稳定性，是指质粒的若干部分被删除；(2)分离不稳定性，即培养期间质粒游离于宿主细胞外。因为许多细胞分裂必定发生在足够的生物量形成之前(以达到大量产品生成)，所以对于大规模应用来说，已放大之基因的稳定性是维持高水平产生放大基因编码的功能性产品的先决条件。在许多情况下，向发酵液内加入抗生素或类似物是有用的，因为这样便能够选择那些含有多拷贝质粒的细胞，而这些质粒是携带抗这些因子的抗性基因的。然而，因为受到有关发酵方法和其产品获得批准之规定的限制，所以在大规模生产过程中，一般不适于使用抗生素。

已发现了另一种避免由于分离不稳性而造成质粒丢失的方法，即将功能上对于宿主细胞必不可少的基因加到载体分子上(E.Ferrariet al.，Biotechnology，3，1003-1007，1985)。但这种方法仍不能确保载体分子的结构稳定性。

如果宿主细胞中包藏有携带可超表达基因的载体分子，则通常将会对已失去超表达该基因能力的细胞产生选择压力。因为超表达将使宿主细胞与未超表达宿主细胞的竞争性(成长速率)，并因为其大量代谢能量消耗在该超表达之基因产物上，故这种超表达对于已转化的宿主细胞确实是一个不利性质。

还有人提出了其他解决结构质粒不稳定性问题的方法。可以争论的是，避免载带于质粒上之基因的表达，能够在指数生长期降低这种选择压力，并从而降低结构不稳定性。其他解决方法是避免使用自主复制的载体分子。一旦已引入的DNA整合到宿主细胞染色体中，就可阻止由载体分子的自主复制引起的不稳定性。

C.H.Duncan等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，3664-3668，1978)已描述了通过同源重组将外来DNA整合到枯草杆菌染色体中的方法，J.G.K.Williams和A.A.Szalay(Gcne，24，37-51，1983)及国际专利申请WO83/00381号中则公开了以同一技术将外来DNA整合到Anacystis nidulans之染色体中的方法。

欧洲专利申请-0127328号描述了通过外源基因的同源重组将携带于质粒载体上时不能稳定保留的基因整合到微生物染色体内的方法。

J.Hofemeister等人(Mol.Gen.Genet.，189，58-68，1983)和A.A.Prorozov等人(Gene，34，39-46，1985)描述了不依赖同源重组，而使用载体PE194，通过非寻常重组将质粒整合到枯草杆菌染色体中的方法。

有关染色体整合之基因的放大，无论是同源的还是异源的，均已有详尽的文献报导(H.Saito et al.，in：Proceedings ofthe forth Internatinal Symposium on Geneticsof Industrial Microorganisms，Kyoto，Japan，PP125130，1982；M.young，J.Gen.Microbiol.130，1613-1621，1984；L.Janniere et al.，Gene，40，47-55，1985；M.G.Sargent and M.F.Bennett，J.Bacteriol.，161，589-595，1985；N.I.Gutterson and D.E.    Koshland，Proc，Natl.Acad.Sci.USA；80，4894-4898，1983；K.Hashiguchi et al.，Agric.Biol.Ghem.，49，545-550，1985；C.R.Wilson and A.E.Morgan，J.Bacteriol.，163，445-453，1985；法国专利申请84.06701号和欧洲专利申请0134048号)。