[发明专利]在原核微生物的染色体DNA中进行稳定的基因放大

权利要求书

1.一种制备在其染色体中包含至少两个DNA序列拷贝的转化的原核宿主细胞的方法，所说的DNA序列编码一种有用的多肽，其中所说的拷贝被对宿主细胞是极端重要的内源性染色体DNA分隔开，所说的方法包括：

在转化条件下，使包含至少一个整合到其染色体中的所说的DNA序列拷贝的受体宿主细胞与(a)包含至少一个所说DNA序列拷贝和至少一个标志基因及一个温度敏感性复制原点的DNA构建物或(b)包含所说DNA构建物的供体宿主细胞结合；

以足够高浓度的抗生素为基础，对其中所说的DNA构建物被整合到所说转化体的染色体中的转化体进行选择；和

从所说的转化体中分离包含至少两个所说的被对宿主细胞是极端重要的内源性DNA分隔开的DNA序列拷贝的转化的真核宿主细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的选择包括：

在一种所说的标志基因对其有抗性的生物杀伤剂存在下培养所说的转化的细胞；并

确定是否存在所说的DNA构建物，或是否提高了所说有用多肽的表达。

3.根据权利要求1的方法，其中所说的鉴定和分离包括：

分离质粒-的转化的细胞；

由所说的质粒-细胞中分离染色体DNA；

使所说的染色体DNA与包含所说DNA构建物或其片段的标记的探针杂交；

在培养基中培养包含至少两个所说DNA序列之拷贝的转化的细胞，其中所说的拷贝是被内源性DNA序列分隔开的。

4.根据权利要求1的方法，其中所说的原核细胞是芽孢杆菌属细胞。

5.根据权利要求1的方法，其中所说的芽孢杆菌是嗜碱芽孢杆菌菌株或地衣形芽孢杆菌菌株。

6.根据权利要求5的方法，其中所说的嗜碱芽孢杆菌菌株是芽孢杆菌新种PB92，所说的地衣形芽孢杆菌菌株是地衣形芽孢杆菌菌株T5。

7.根据权利要求1的方法，其中所说的有用多肽是一种酶。

8.根据权利要求7的方法，其中所说的酶是丝氨酸蛋白酶或淀粉酶。

9.根据权利要求8的方法，其中所说的丝氨酸蛋白酶在核苷酸序列上与来自芽孢杆菌新种PB92的蛋白水解酶编码基因至少有70％的同源性。

10.根据权利要求8的方法，其中所说的丝氨酸蛋白酶基本上具有下列氨基酸序列：H₂N-A-Q-B-V-b-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V- K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.

11.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA构建物选自：

大小为7.6Kb，物理图谱如图6B所示的重组质粒pMAX-4，该质粒包含编码芽孢杆菌新种PB92菌株中所含有的芽孢杆菌PB92蛋白酶的基因，衍生于质粒pE194的温度敏感性复制原点和新霉素抗性基因，或

大小为8.2Kb，物理图谱如图8所示的重组质粒pE1atB，该质粒包含编码贮存于枯草芽孢杆菌1S-53(CBS467.83)中的质粒pGB34中所含有的α-淀粉酶的基因，衍生于质粒pE194的温度敏感性复制原点和新霉素抗性基因。