[发明专利]肽的制造方法

说明书

本发明是关于制造一种含多肽物质的方法，特别是关于制造蛋白质的方法，以及用酶类蛋白质催化制备生物物质的方法。

在过去的十年里，重组DNA技术越来越多地用于制造工业上重要的生物物质。为此，已对编码多种医学上重要的人体蛋白质的DNA序列进行了克隆，它包括胰岛素、血纤维蛋白溶酶原活化剂、α₁-抗胰蛋白酶、以及凝固因子Ⅷ和Ⅸ。目前，虽然出现了重组DNA技术，然而这些蛋白质通常从血液和细胞组织中提纯，该方法成本昂贵且费时，并且可能会引起传染介质的传播，这些传染介质会引起艾滋病和肝炎。

尽管在细菌中表达DNA序列，对于产生所需的医学上重要的蛋白质来说是一个吸引人的计划，然而事实上细菌作为宿主通常是不能令人满意的，因为在细菌细胞中，外来蛋白质不稳定而且没有合格处理过。

认识到这个问题，人们对在哺乳动物细胞组织培养物中的克隆基因的表达方式作了尝试，而且在某种情况下已经证明这是一个可行的策略，然而动物细胞的间歇发酵培养是昂贵的、但却是技术上需要的过程。

因此，需要一种产率高、成本低的制造生物物质的方法，例如恰当修饰真核生物多肽的方法，这种方法的一个优点是对人体没有传染介质。

根据本发明的第一方面，提供一种制造含多肽物质的方法，该方法包括将编码多肽的DNA序列插入编码哺乳动物乳清蛋白的基因中，用这种办法在成年雌性哺乳动物的乳腺中表达DNA序列。通常在转译后修饰之前或者最好是在之后从成年雌性哺乳动物的乳液中回收该物质。

在本说明书中使用的术语“多肽”是指包含氨基酸链的分子，无论链的长度对于划为蛋白质是否合适，多肽最好具有足够长的分子而成为蛋白质。“含多肽物质”可以是多肽本身，或者可以是一种经修饰的(例如糖基化的)多肽，此外，或者也可以是在多肽经转译后修饰而交叉连接的物质。

本发明可用于生产肽激素、血液凝固因子(特别是Ⅷ和Ⅸ因子)或它们(特别是Ⅷ和Ⅸ因子)的亚基、血液蛋白质(例如β-珠蛋白)和血清蛋白(例如α₁-抗胰蛋白酶)、粮食蛋白、包括天然或改进的宿主哺乳动物的乳蛋白、或酶。

本发明产生的酶能在原位作用于在乳腺中的底物，因此，可以看出本发明包括一种生产酶反应产物的方法，该方法通过将编码酶的DNA序列插入编码哺乳动物乳清蛋白的基因中，以实现该序列在成年雌性哺乳动物乳腺中的表达，然后用该酶作用于酶的一种或多种底物的来催化反应产物的制备，该反应产物一般从成年的雌性哺乳动物的该乳液中回收。

最好在试管中，将编码肽的DNA序列，(所需的DNA序列)插入到乳清蛋白质基因中形成融合基因，这种乳清蛋白基因可以在成年的雌性哺乳动物中表达。通过向受精的哺乳动物的卵子注射融合基因，从而将融合基因插入种系中，此后，经注射的受精卵发育为成年的雌性哺乳动物。人们预计并非所有注射过的卵都能发育成表达所需的DNA序列的成年雌性哺乳物。此外，将近一半的动物是雄性，在下一代生育雌性动物。

将外源DNA序列插入到哺乳动物种系中的有关技术已用于小鼠。目前，最有效的途径需要将几百个直链DNA分子直接显微注射到一个受精卵细胞的原胞核中，这是本发明的优选方法。然后将显微注射过的卵转移到假孕养母的输卵管中，进行培养。Brinster et al在Proc Natl Acad Sci 82(1985)4438-4442中报道培养的小鼠大约有25％遗传了一个或多个显微注射的DNA拷贝。从商业观点出发，显然在本发明中，最好将具有高产乳率的哺乳动物作为宿主哺乳动物。因此，优选选用家畜，例如绵羊、猪和牛，下面将进一步详细讨论。

研究大量家畜需要相当大的投资，尤其是在所需动物的数目及其成本方面。每个超数排卵的小鼠产生30个卵是正常的，而母羊排卵数只有3至5个。所遇到的另一个问题是农场动物的卵还不透明，这是由于它存在大量的囊，这就使得鉴别以及向其原胞核进行成功注射更为困难。然而，向兔子、绵羊和猪的卵中注射DNA已由Hammer et al在Nature 315(1985)680-683中作了报道，他将金属硫因-生长激素融合基因插入这三种动物的种系中。对2035个猪卵进行注射和转移，有192只小猪出生，其中20只带有融合基因。对于绵羊，结果却并不如此令人鼓舞，对1032个羊卵进行注射和转移，只有73只羊出生，其中只有一只羊含有外源DNA序列。