[发明专利]百日咳抗原的纯化

说明书

本发明涉及用于配制防治百日咳博德特氏菌（Bordetella    pertussis）感染的疫苗的抗原物质的生产方法。

迄今为止，广泛使用杀死整个细胞的百日咳博德特氏菌疫苗来防治百日咳。对全细胞疫苗不同的反应以及由此而造成公众不大欢迎这些疫苗，导致进行了相当多的研究以企图生产出一种含有分离的百日咳抗原的较为安全的无细胞疫苗。

无细胞疫苗里被认为是有效成份的三种独特的抗原部分是（1）淋巴细胞增多促进因素（LPF），（2）丝状血红细胞凝集素（FHA）及（3）菌毛凝集原（菌毛）。

那些被称作“凝集原2和3”的凝集原是包括在由第（3）部分，即菌毛凝集原所代表的抗原纲。（凝集原2和3亦可称为“Ag₂₊₃”）凝集原2和3可视作含有从至少产生凝集原2和3抗原的菌体分出的菌毛。（凝集原3被某些工作者称为“凝集原6”，而凝集原3和6可能就是同一东西）。

虽然少量地分离这些部分的过程已知道，但目前仍未能从百日咳博德特氏菌的培养物里有效地和分别生产出所有三个部分。例如，EP-A-0003196介绍了一个获得淋巴细胞增多促进因素（LPF）的过程。该过程是通过将百日咳博德特氏菌细胞衍生出来的液体制剂通过用唾液酸蛋白质作为固定相的亲和层析而完成的。然而所用的液体制剂是从匀浆了的细胞浆而来，同时所介绍的过程对于生产LPF是有效的，但该专利并未指出分开分离丝状血红细胞凝集素（FHA）和凝集原2和3（Ag）。

为了从百日咳博德特氏菌培养物的上清液里获得淋巴细胞增多促进因素（LPF）和丝状血红细胞凝集素（FHA）已经提出了一些步骤，例如，Sato等人（Infection    and    Immuity    July    1983，Vol.41.P.313-320）介绍了通过羟基磷灰石层析柱的梯度吸附从培养物的上清液纯化LPF和FHA。

然而，这些前人的文献并不涉及淋巴细胞增多促进因素（LPF），丝状血红细胞凝集素（FHA）及菌毛凝集原这全部三种的共一生产。

为了生产包含所有这三种抗原部分的疫苗组合物，最好获得产量相近的3个所需的部分，因为它有利于这些部分在最后制成的疫苗里以大致相等的比例出现。

根据本发明，它提供了一个从百日咳博德特氏菌培养液生产淋巴细胞增多促进因素（LPF），丝状血红细胞凝集素（FHA）及至少一种菌毛凝集原的过程。该过程包括以下各步：

a）把培养物分为细胞部分和上清液部分，

b）浓缩上清液部分，

c）分级分离浓缩了的上清液部分以分离出含LPF及FHA的分部，以及

d）从细胞部分至少分离出一种菌毛凝集原。

在（d）步较理想的是，从细胞部分分离出至少含有凝集原2和3（Ag₂₊₃）的菌毛凝集原。分离出的凝集原可任意地再包括凝集原4，5和6中的任一种或多种。

本发明还提供生产含淋巴细胞增多促进因素（LPF），丝状血红细胞凝集素（FHA）及至少一种菌毛凝集原的疫苗组合物。该菌毛凝集原包括混合（ⅰ）LPF，（ⅱ）FHA及（ⅲ）至少一种菌毛凝集原，上述的LPF，FHA以及至少一种菌毛凝集原是由上述（a）至（d）步骤生产的，而且在混合之前或之后进行了脱毒性。比较理想的是，该菌毛凝集原至少包括凝集原2和3（Ag₂₊₃）。该菌毛凝集原亦可至少包括凝集原4，5和6中之一种。

依据本发明，借助分离LPF，FHA以及至少一种菌毛凝集原就可从单独的液体培养物获得的这些成分，其产量足以使它们能按治疗上有效的份量复合到疫苗组合物里。

正如所指出的那样，在进行本发明的生产过程时，实行分级分离（C）步之前，先行浓缩上清液部分，同时兴幸地发现，通过实施各步骤的这个程序，即从细胞部分分出上清液部分之后实行浓缩步骤（b），能够避免不能接受的FHA的损失。

将培养物分为细胞部分和上清液部分的步骤最好在其pH值大于7时离心进行，在pH大于或等于8时进行较好，培养液的pH值介乎7.5-9.0之间则更好。