[其他]逆向斑点分子杂交技术

说明书

本发明涉及一项新的分子杂交技术，特别是逆向斑点分子杂交技术，更为具体地是涉及人体乙肝病毒的一种新的检测方法。

乙型病毒性肝炎的病原体乙肝病毒（HBV）是一种引起人体肝炎的脱氧核糖核酸（DNA）的病毒。据统计，目前全世界已有二亿多人受到乙肝病毒的感染，大量流行病学资料表明，它的感染与人体原发性肝癌的发生密切相关。

HBV的完整病毒为：含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的外壳包裹和乙型肝炎核心抗原（HBc    Ag）、病毒基因组-DNA与该病毒的脱氧核糖核酸聚合酶（DNA聚合酶）构成的核心，它又称为Dane颗粒。其平均直径为42毫微米。由于表面抗原（HBs    Ag）基因在肝细胞内过量表达，因而在乙肝携带者血清内还可发现平均直径为22毫微米的表面抗原颗粒，由于它并不含有该病毒的基因组DNA及其DNA聚合酶，因而这种颗粒无致病性。在已有技术中，已发展了以下几种检测乙型肝炎病毒感染的方法：

1.利用免疫血清学方法测定乙型肝炎两对半抗原及相应的抗体标志，包括乙型肝炎表面抗原（HBs    Ag）及其抗体（抗HBs）、e抗原（HBe    Ag）及其抗体（抗HBe）以及乙型肝炎核心抗原的核体（抗HBc）。这是目前临床应用的常规方法。由于e抗原在一定程度上代表了核心抗原的存在，因而它的存在对判定乙肝感染性有一定的临床意义。然而，上述两对半标志物，包括e抗原本身并不直接涉及乙肝病毒复制、增殖，因而它们只能是乙型肝炎病毒感染的间接标志。

2.HBV DNA斑试测定，这是近年来发展的一项新技术。其优点是直接测定HBV的病毒基因组，因而是一项测定乙型肝炎感染性的直接标志。但这一方法测定的结果，尚不能排除血清中可能存在游离的HBV DNA片段，它们可能是降价的HBV DNA，同时由于无病毒的外壳及该病毒的聚合酶，因而无感染能力。同时，该方法测定时，首先必须经遗传工程方法扩增含HBV DNA顺序的重组质粒，然后，再把它的载体DNA切除，上述纯化物的HBV DNA应用制品翻译（Nick-trans Iation）的方法制得^3eP-HBV DNA探针对血清样品进行斑试测定，因而方法较繁复，成本较高。

3.HBV DNA聚合酶的测定。早在1973年，凯普莱恩（Kaplan）等应用氚标记-三磷酸脱氧胸苷（³H-TTP）及其他三个DNA合成的前生物三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷和三磷酸脱氧胞苷（dATP、dCTP、dGTP）渗入的方法测定HBV内源的DNA聚合酶，对于HBV DNA聚合酶的测定，反应了复制型的病毒的存在，因而为乙型肝炎的检测提供了直接标志。但该方法仅通过三氯醋酸（TCA）沉淀法测定³H-TTP渗入后的DNA产物的放射强度，经过与几个同时测定的正常血样³H-渗入后的平均值进行数理统计来判定其聚合酶的活力。虽然近年来此方法已有不少改进，如采用三氯醋酸的纸层析来代替三氯醋酸直接沉淀法以减少³H-TTP的污染等，但由于方法颇为复杂，同时又无法排除血清中可能存在的其他病毒如EBV等DNA聚合酶的干扰，因而仍不能成为特异地确定乙型肝炎病毒感染性的理想标志。

本发明的目的在于克服上述各种乙型肝炎病毒感染检测方法所存在的缺点，提供一种简便的检测方法，确定乙肝病毒感染性的直接而可靠的标志，这种方法便是我们在国际上首创的逆向斑点分子杂交技术。