[其他]逆向斑点分子杂交技术

权利要求书

1、一种逆向斑点分子杂交的检测方法，包括以下步骤

对含有完整HBV DHA顺序的重组质粒作变性处理；

将所述经变性处理的重组质粒放入冰溶中速冷；

在所述速冷后的重组质粒内加入氢氧化钠使后者的浓度为0.2-0.50克分子；

将所述的氢氧化钠溶液点样于硝基纤维滤膜，并使之干燥；

将所述点样后的滤膜用缓冲系统浸泡中和，并使之干燥；

将所述干燥后的滤膜放入预杂交液中进行预杂交；

将受捡血清加入非离子去垢剂及聚合酶保护剂；

将所述血清再加入包含缓冲系统及四种DHA合成的前生物三磷酸脱氧核苷、其中至少有一种带有可显示的标记物的反应混合液、进行培育、制成含标记物的HBV DHA分子探针；

将所述含标记物的HBV DHA分子探针加入杂交混合液，作变性处理，制成单链的含标记物的HBV DHA分子探针；

将所述的单链含标记物的HBV DHA分子探针放入冰浴中速冷；

将所述速冷后的单链的含标记物的分子探针与上述经预杂交液杂交处理的硝基纤维杂交滤膜杂交，并用洗脱液洗去未杂交的游离的标记物；

将所述杂交后的硝基纤维杂交滤膜干燥后，通过标记物显示的方法来判定受捡血清中感染性的HBV的存在。

2、按权利要求1所述的方法，其中，所述的反应混合液中所述的可显示的标记物是放射性同位素，并且，上述使标记物显示的方法是采用使X-线感光片作放射性自显影的方法。

3、按权利要求1的方法，其中，所述的反应混合液中所述的可显示的标记物是生物素（Biotin），并且，上述使标记物显示的方法是采用生物素与抗生物素蛋白（AVidine）特异结合，通过酶标法（ELISA）、抗抗生物素抗体的萤光免疫法或放射免疫法显示。

4、按权利要求2的方法，其中，所述的放射性同位素是³²-P、¹²⁵I-或³⁵S-的dNTP。

5、按权利要求1的方法，其中，所述的缓冲系统由中性缓冲液、氯化镁和氯化铵组成。

6、按权利要求5的方法，其中，所述的中性缓冲液是三羟甲基氨基甲烷、磷酸、硼酸或其他常规中性缓冲液。

7、按权利要求1所述的方法，其中所述的反应混合液温度为37℃，作用时间为2-5小时。

8、按权利要求1所述的方法，其中，所述的预杂交由0.2%牛血清白蛋白，0.2%聚乙烯基吡咯烷酮液0.2%聚蔗糖、0.9克分子浓度氯化钠及0.09克分子浓度柠檬酸钠组成。

9、按权利要求1的方法，其中，所述的预杂交温度为43℃，预杂交时间为4-24小时。

10、按权利要求1的方法，其中，所述的杂交混合液包括30-60%甲酰胺、0.3克分子浓度氯化钠、0.03克分子浓度柠檬酸钠、0.2%焦磷酸钠、0.02%牛血清白蛋白、0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯吡咯烷酮及100微克/毫升鱼精DHA。

11、按权利要求10的方法，其中，所述的杂交混合液还包括右旋糖苷硫酸酯。

12、按权利要求1的方法，其中，参入含标记的HBV  DHA分子探针的杂交混合液变性处理温度为100℃，作用时间为5-10分钟。

13、按权利要求10的方法，其中，所述的鱼精DHA是经超声断链及100℃变性的单链鱼精DHA。

14、按权利要求1的方法，其中，所述的单链含标记物的HBV  DHA分子探针与所述经预杂交液杂交处理的硝基纤维杂交滤膜杂交的温度随杂交混合液中甲酰胺浓度的改变而改变，在甲酰胺浓度为50%时，杂交温度为43℃，杂交时间为18-36小时。

15、按权利要求1的方法，其中，所述的洗脱液先后采用0.3克分子浓度氯化钠和0.03克分子浓度柠檬酸钠组成的洗脱液以及0.3克分子浓度氯化钠、0.03克分子浓度柠檬酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠组成的洗脱液。