[发明专利]一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。所述检测体系包括：含5‑甲基胞嘧啶和/或5‑羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5‑甲酰胞嘧啶和/或5‑羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。本发明设计全新的检测体系，以含5‑甲基胞嘧啶(5‑mC)和/或5‑羟甲基胞嘧啶(5‑hmC)的DNA片段为底物，结合特定的氧化、转化过程，将荧光值与酶活偶联，实现双加氧酶的酶活检测，成本低，操作简单，且只需利用PCR仪和酶标仪等常见仪器即可准确测定TET酶活。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法。

背景技术

甲基化修饰是表观遗传学调控的一种重要方式，且5-甲基胞嘧啶(5mC)是DNA最常见的修饰碱基。双加氧酶，是使氧分子中的两个氧原子全部与底物相结合的氧化酶的总称。铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶[α-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases(α-ODDs)]属于广泛分布于自然界中的非血红素铁蛋白，是一种参与多种氧化还原反应的重要酶类，其反应底物种类多样，可以是蛋白质，例如脯氨酰羟化酶(PHD)等；也可以是小分子化合物，例如核酸等。TET(ten-eleventranslocation)酶是生物体内存在的一种Fe²⁺和α-酮戊二酸依赖的双加氧酶，TET酶可通过一系列的氧化反应，可将5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，然后再转化为5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，而5caC能被DNA糖苷酶特异识别并切除，随后偶联碱基切除修复机制，实现DNA主动去甲基化。目前，TET酶广泛应用于甲基化测序试剂盒，如TET辅助的重亚硫酸盐测序，吡啶硼烷测序(TAPS)(TET-assisted pyridineboranesequencing)、TAPSβ及CAPS，以及基因组甲基化测序(WGBS)等。

目前，TET酶活性测定方法包括酶联免疫吸附法、点杂交法和液相色谱-串联质谱法等。多采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TET酶活，如市面上的成品试剂盒，通过抗体显色法精准定量分析TET氧化5mC生成的5hmC的含量，但是无法分析后续氧化产物5caC的含量，因此无法准确测定TET酶活。通过点杂交技术，5mCDNA经过TET氧化后，可用5mC、5hmC、5fC和5caC抗体分别进行杂交，虽然可以检测多个样本，但是操作复杂、效率低下，成本高昂。另外，液相色谱-串联质谱法，将TET氧化的5mCDNA回收经过核酸酶消解，通过LC-MS分析底物及各个阶段氧化产物的占比，背景重，操作复杂，成本高昂。

综上所述，开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法，对于双加氧酶应用领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法，本发明设计全新的检测方案，以期开发成本低，操作简单且可准确测定双加氧酶活的方法。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种双加氧酶的酶活检测体系，所述检测体系包括：含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5-甲酰胞嘧啶(5fC)和/或5-羧基胞嘧啶(5caC)转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。