[发明专利]一种双加氧酶的酶活检测体系、试剂盒及方法在审
| 申请号： | 202310795518.8 | 申请日： | 2023-06-30 |
| 公开（公告）号： | CN116606902A | 公开（公告）日： | 2023-08-18 |
| 发明（设计）人： | 刘想;刘雪 | 申请（专利权）人： | 武汉翌圣生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/26 | 分类号： | C12Q1/26;C12Q1/6851;C12Q1/6876;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 刘逸卿 |
| 地址： | 430206 湖北省武汉市东湖新技术开发区高*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 双加氧酶 活检 体系 试剂盒 方法 | ||
1.一种双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段、所述DNA片段的引物、用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂、双加氧酶反应Buffer和DNA荧光定量试剂。
2.根据权利要求1所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述DNA片段的长度为200-600bp；优选为454bp；
优选地，所述DNA片段的至少一端未被5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶甲基化修饰；
优选地，所述引物中含有14～17个C-G碱基对；
优选地，所述引物的3’端末尾含有4～7个连续的C-G碱基。
3.根据权利要求1或2所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂包括硼烷吡啶络合物、2-甲基吡啶硼烷、硼烷、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、1,3-茚满二酮或丙二腈中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系，其特征在于，所述双加氧酶反应Buffer含有10～100mM缓冲体系、10～300mM氯化钠、0.1～10mMα-酮戊二酸、0.1～10mML-抗坏血酸、0.1-10mM三磷酸腺苷和0.01～2mM二硫苏糖醇和0.1～50mM亚铁盐化合物。
5.如权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系在制备双加氧酶的酶活检测产品中的应用。
6.一种双加氧酶的酶活检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系。
7.权利要求1-4任一项所述的双加氧酶的酶活检测体系或权利要求6所述的双加氧酶的酶活检测试剂盒在双加氧酶的酶活检测体中的应用。
8.一种双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述方法包括：
将含有双加氧酶的待测样品与权利要求1中所述含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，根据标准曲线计算双加氧酶的酶活。
9.根据权利要求8所述的双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述标准曲线的构建方法包括：
将已知梯度浓度的双加氧酶分别与权利要求1中所述含5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的DNA片段和双加氧酶反应Buffer混合，进行酶氧化反应；
酶氧化反应终止后，将反应体系与所述用于将5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶转化为非胞嘧啶的试剂进行混合，进行转化反应；
将转化反应的产物与所述DNA片段的引物混合，进行PCR扩增；
将PCR扩增产物与DNA荧光定量试剂混合，检测荧光值，以荧光值为纵坐标双加氧酶的浓度为横坐标构建标准曲线。
10.根据权利要求8或9所述的双加氧酶的酶活检测方法，其特征在于，所述双加氧酶包括催化5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰胞嘧啶和/或5-羧基胞嘧啶的双加氧酶；
优选地，所述双加氧酶包括mYOX酶和TET酶。
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