[发明专利]一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法及试剂盒

说明书

灵敏度是评价传感器分析性能的重要参数之一。我们构建一种比色传感技术用于高灵敏度检测黄曲霉毒素B1(AFB1)。AFB1存在时，AFB1首先与Aptamer‑T的双链复合物中的Aptamer特异性结合，释放出引发链T。引发链T依次打发夹探针H1、H2和H3，并形成H1‑H2‑H3复合物，完成第一级催化发夹自组装反应(CHA)。H1‑H2‑H3该复合物的粘性末端打开发夹H4和H5，完成第二级CHA反应，并使得包被在发夹H5茎部区的富G序列暴露出来。暴露出来的富G序列与hemin结合形成hemin/G四链体DNA酶催化生色底物产生颜色信号。本方法利用Aptamer和hemin/G四链体DNA酶代替抗体和生物酶，能够降低检测成本；其次级联信号放大技术的使用能极大地提高该方法的灵敏度，检出限达到13.49pM。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1检测方法及试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AFB1)是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，在所有霉菌毒素中，AFB1分布范围广而且毒性最强，严重威胁人类和动物的健康黄曲霉毒素对农产品、饲料以及食品的污染种类繁多、范围广泛。AFB1具有强烈的致癌性与致畸性，被WHO确定为I类致癌物。AFB1主要靶器官为肝脏，不小心摄入大量AFB1时，会导致人类或动物发生急性中毒，症状表现为肝脏细胞坏死、肝脏肿大，严重者可致亡；当人类或动物较长时间食用含有或携带AFB1的食物或饲料时，很容易发生慢性中毒，它能让人或者动物的食欲减退，还可以降低它们的免疫力，导致它们生长发育迟缓、严重时还可导致肝硬化、肝癌等。因此，对受黄曲霉毒素B1污染的食品和饲料进行筛查对于保障食品安全和人体健康、维护消费者权益具有重要的意义，而这有赖于发展有效、可靠的检测方法。

目前，包括薄层层析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、免疫测定法、电化学技术、荧光检测器及比色生物传感器等广泛应用于黄曲霉毒素B1的检测，这类仪器分析方法具有灵敏度高、准确性和重复性好的优点，但所需仪器昂贵，检测成本高，而且对实验操作人员有较高要求，限制了此类仪器分析方法在大规模样品和现场检测中的应用。因此开发具有操作简单、成本低、稳定性高的黄曲霉毒素B1检测方法仍然具有十分重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种黄曲霉毒素B1的高灵敏度检测方法。为最大限度的提高检测灵敏度，本发明设计了一种基于双催化发夹自组装(CHA)循环实现信号放大的适配体传感器，借助hemin/G-四链体DNA酶比色技术检测花生中的AFB1。如图1所示，当黄曲霉毒素B1存在时，它与Aptamer-T双链复合物中的Aptamer特异性结合，释放出引发链T。引发链T参与第一个CHA信号放大反应，首先打开发夹H1，被打开的发夹H1继续打开发夹H2，H2继续打开发夹H3从而替换出引发链T，替换出的引发链T继续参与第一个CHA循环；所形成的H1-H2-H3复合物产物进入第二个CHA信号放大反应循环，H1-H2-H3复合物的粘性末端首先打开发夹H4的茎部区，被打开的发夹H4剩余部分的序列可以打开发夹H5，使得包被在发夹H5茎部区的富G序列暴露出来，而H1-H2-H3复合物又被替换出来再一次参与第二个信号放大的循环。发夹H5中的富G序列可以在hemin和K⁺存在下形成hemin/G四链体DNA酶，并催化H₂O₂介导的生色底物TMB产生蓝色信号，在终止液H₂SO₄的作用下，反应溶液最终呈现为稳定的黄色溶液，该溶液体系用紫外可见分光光度计检测在450nm处有最大吸收峰，随着AFB1浓度的增加，检测到的比色信号也逐渐增强，因此，可以实现对AFB1的定量检测。当目标物AFB1不存在时，引发链T由于跟核酸适配体Aptamer杂交形成稳定的Aptamer-T复合物而不能释放出引发链T参与CHA循环放大反应，使得后续反应无法发生，反应体现显现弱的背景信号。