[发明专利]一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法

说明书

本发明公开了一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，包括以下步骤：将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；用链霉蛋白酶消化；用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，荧光标记的山羊抗鼠IgG和荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，荧光标记的山羊抗鼠IgG和荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况，该方法能够直观的分析同源染色体是否存在不完全联会或重组次数异常等情况。

技术领域

本发明涉及一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法。

背景技术

卵母细胞的第一次减数分裂进程包括前期、中期，后期和末期，前期所占时间最长，包括细线期，偶线期，粗线期和双线期，其中粗线期维持的时间又是最长的。在偶线期和粗线期完成了染色体发生了剧烈的形态和和结构变化，主要包括同源染色体的联会或重组，该过程一旦出错便可导致卵母细胞质量下降或非整倍体改变。

但目前分析联会或重组的技术方法主要依赖蛋白印迹或免疫组化等方法，此种方法不能直观的看到同源染色体的联会，更不能分析同源染色体间的重组位点等情况，只能定性的分析参与联会或重组过程中蛋白的表达情况。另外处于第一次减数分裂前期的卵母细胞获取困难，且外围有一层透明带，会干扰细胞的低渗和涂片后的细胞破裂，导致分裂相或者联会复合体聚集不分散，荧光染色后不能有效直观的分辨未完全联会的染色体数量，同源染色体非姐妹染色单体间的重组情况等指标，在一定程度上限制了对减数分裂进程的深入研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，该方法能够直观的分析同源染色体是否存在不完全联会或重组次数异常等情况。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；

(2)用链霉蛋白酶的溶液重悬细胞，并经孵育、离心后收集沉淀；

(3)用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；

(4)以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或，以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。

步骤(1)中，蔗糖溶液的浓度为0.02～0.5M。

步骤(2)中，链霉蛋白酶的溶液质量浓度为0.05～0.6％，所述链霉蛋白酶的溶液通过将链霉蛋白酶溶解在M2溶液中得到；所述孵育的条件为35～37℃孵育5～20分钟。

步骤(3)中，含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液中，十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的质量浓度分别为0.01～0.1％、0.1～0.5％、0.5～4％。

步骤(3)中还包括：将固定后的载玻片置入洗涤液中清洗，然后每张玻片滴加封闭液，置于饱和湿度的暗盒中封闭2～8小时。

步骤(4)中，检测初级卵母细胞的同源染色体间的联会时，进行以下步骤：