[发明专利]一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法

权利要求书

1.一种分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将正处于第一次减数分裂前期的初级卵母细胞在蔗糖溶液中重悬并离心；

(2)用链霉蛋白酶的溶液重悬细胞，并经孵育、离心后收集沉淀；

(3)用含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的PBS溶液重悬细胞对细胞进行固定，然后将细胞悬液固定在载玻片上；

(4)以羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体间的联会；或，以羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体为一抗，Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG为二抗，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。

2.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(1)中，蔗糖溶液的浓度为0.02～0.5M。

3.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(2)中，链霉蛋白酶的溶液质量浓度为0.05～0.6％；所述孵育的条件为35～37℃孵育5～20分钟。

4.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(3)中，含十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的溶液中，十二烷基硫酸钠、TritonX100、多聚甲醛的质量浓度分别为0.01～0.1％、0.1～0.5％、0.5～4％。

5.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(3)中还包括：将固定后的载玻片置入洗涤液中清洗，然后每张玻片滴加封闭液，置于饱和湿度的暗盒中封闭2～8小时。

6.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(4)中，检测初级卵母细胞的同源染色体间的联会时，进行以下步骤：

(a)用稀释液按照1:100～1:300的比例稀释羊抗鼠的SYCP1抗体和羊抗鼠的SYCP3抗体，然后滴加在载玻片上，4℃孵育10～15小时；

(b)去除一抗残余液体，将玻片置于洗涤液中进行清洗；

(c)用稀释液按照1:500～1:1000的比例稀释Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗，将二抗滴加到载玻片上，覆盖封口膜，置于饱和湿度暗盒中，室温孵育1～4小时；

(d)去除二抗残余液体，将玻片置于洗涤液中清洗，然后在载玻片上滴加抗荧光猝灭剂，加盖盖玻片，玻片周围进行固定，然后置于正置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察同源染色体间的联会。

7.根据权利要求1所述的分析初级卵母细胞减数分裂过程中同源染色体联会或重组的方法，其特征在于，步骤(4)中，检测同源染色体非姐妹染色单体间重组情况时，进行以下步骤：

(A)用稀释液按照1:100～1:300的比例稀释羊抗鼠的SYCP3抗体和羊抗兔的MLH1抗体，然后滴加在载玻片上，4℃孵育10～15小时；

(B)去除一抗残余液体，将玻片置于洗涤液中进行清洗；

(C)用稀释液按照1:500～1:1000的比例稀释Dylight 549荧光标记的山羊抗鼠IgG和Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗，将二抗滴加到载玻片上，覆盖封口膜，置于饱和湿度暗盒中，室温孵育1～4小时；

(D)去除二抗残余液体，将玻片置于洗涤液中清洗，然后在载玻片上滴加抗荧光猝灭剂，加盖盖玻片，玻片周围进行固定，然后置于正置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察同源染色体非姐妹染色单体间重组情况。