[发明专利]一种利用冻精管冻存生物细胞的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：(1)收集培养的生物细胞，(2)冻精管的灌装与密封，(3)细胞冻存程序，(4)细胞复苏培养。本发明具有的优点是：采用本发明的技术方案可以使用冻精管进行少量生物细胞的保存，并保证冻存细胞的复苏活性达到与手动冻存相近的程度，具有极大的推广价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用冻精管冻存生物细胞的方法。

背景技术

我国具有丰富的畜禽品种资源，不但有世界著名高产品种引进，还有大量适应性强、生产性能高的优良地方品种。由于发展滞后，我国地方品种资源尚未得到足够的重视，在自身利用中也存在一定问题，使得地方品种优势呈现逐渐衰减的趋势，急需保护和保存。生物样本保存是种质资源保存的一个重要方法，其中培养生物细胞冷冻保存可为种质资源研究、克隆复苏种群提供材料，是一种高效率、低成本的保存方法。然而，由于遗传物质在传至一定代数后会发生癌变，可作为种质资源备份的生物细胞并不能长期培养传代。目前，冻存生物细胞的方法主要有机器冷冻、程序冻存盒冻存、手动冻存三种。机器冻存需要用到特定仪器，以精液和人类胚胎为主，常见于医院等物质条件更为丰富的场所；程序冻存盒操作简单、条件要求不高，应用范围较广；手动冻存条件要求最低，应用范围极广。在常见的冻存方法中，冻存管容量为2.0mL，所含细胞数量远超体细胞克隆等实验需求，多出的细胞如果继续培养冻存，多代后将无法适应实验需求，造成样本资源的浪费。而冻精管容量为300-400μL，更适合一般实验用量。因此，有必要开发一种利用冻精管保存生物细胞的方法，以避免珍稀样本的浪费。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，所述的冻存方法可以使用冻精管进行少量生物细胞的保存，并保证冻存细胞的复苏活性达到与手动冻存相近的程度，具有极大的推广价值。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，具体包括以下具体步骤：

(1)收集培养的生物细胞：

当细胞生长至70％～80％融合度时准备消化冻存，用移液器沿培养皿边缘移除培养液，加入含双抗的DMEM清洗1次，移除DMEM，加入100～500μl1％胰蛋白酶，镜下观察细胞形态变圆或肉眼观察到细胞成片脱离培养皿壁后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后1000rpm离心3min，弃上清，加入细胞冻存液重悬；

(2)冻精管的灌装与密封：

用1mL移液枪取350μl混匀的细胞液，从无棉塞的一侧注入冻精管，微微倾斜冻精管，使液体流动至冻精管中部，两端留出1～1.5cm；使用止血钳将无棉塞的一侧冻精管约0.5cm长度夹扁，将止血钳置于酒精灯上灼烧约2～3s，从已夹扁的冻精管中部向管口夹持冻精管约1～3s，观察冻精管是否被烫坏；重复灼烧、夹持动作1～2次，倾斜冻精管，观察液体是否流动，调整封口直到液体不流动为止；

(3)细胞冻存程序：

将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10～15min，-20℃、30min，-80℃、360～380min，转移至液氮中长期保存；

(4)细胞复苏培养：

从液氮中取出冻精管，置于38℃水浴解冻30s；解冻后的冻精管用酒精棉球消毒其中一头，观察是否有漏液现象；在无菌环境下，剪开冻精管已消毒的一头，将冻精管垂直立于离心管管口上方，剪开另一头，使液体流入离心管中，1500～3000rpm离心5min，弃上清，加入培养基吹打重悬，重复离心1次，弃上清，加入培养基吹打重悬，转移至培养皿或培养瓶中按一般细胞培养要求培养。

进一步说明，步骤(1)中，所述细胞为293T细胞、水牛骨骼肌成纤维细胞或其他动物组织细胞。