[发明专利]一种利用冻精管冻存生物细胞的方法

权利要求书

1.一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：

(1)收集培养的生物细胞：

当细胞生长至70％～80％融合度时准备消化冻存，用移液器沿培养皿边缘移除培养液，加入含双抗的DMEM清洗1次，移除DMEM，加入100～500μl1％胰蛋白酶，镜下观察细胞形态变圆或肉眼观察到细胞成片脱离培养皿壁后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀后1000rpm离心3min，弃上清，加入细胞冻存液重悬；

(2)冻精管的灌装与密封：

用1mL移液枪取350μl混匀的细胞液，从无棉塞的一侧注入冻精管，微微倾斜冻精管，使液体流动至冻精管中部，两端留出1～1.5cm；使用止血钳将无棉塞的一侧冻精管约0.5cm长度夹扁，将止血钳置于酒精灯上灼烧约2～3s，从已夹扁的冻精管中部向管口夹持冻精管约1～3s，观察冻精管是否被烫坏；重复灼烧、夹持动作1～2次，倾斜冻精管，观察液体是否流动，调整封口直到液体不流动为止；

(3)细胞冻存程序：

将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10～15min，-20℃、30min，-80℃、360～380min，转移至液氮中长期保存；

(4)细胞复苏培养：

从液氮中取出冻精管，置于38℃水浴解冻30s；解冻后的冻精管用酒精棉球消毒其中一头，观察是否有漏液现象；在无菌环境下，剪开冻精管已消毒的一头，将冻精管垂直立于离心管管口上方，剪开另一头，使液体流入离心管中，1500～3000rpm离心5min，弃上清，加入培养基吹打重悬，重复离心1次，弃上清，加入培养基吹打重悬，转移至培养皿或培养瓶中按一般细胞培养要求培养。

2.根据权利要求1所述的一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞为293T细胞、水牛骨骼肌成纤维细胞或其他动物组织细胞。

3.根据权利要求1所述的一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述完全培养基为90mLDMEM高糖培养基+10mLFBS胎牛血清+1万U青链霉素。

4.根据权利要求3所述的一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞冻存液为所述完全培养基90mL+DMSO二甲基亚砜10mL或所述完全培养基80mL+DMSO二甲基亚砜20mL。

5.根据权利要求1所述的一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述冻精细管为富士平冻精细管、卡苏牛冻精细管。

6.根据权利要求1所述的一种利用冻精管冻存生物细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞冻存程序：将灌装密封后的细胞进行冻存，冻存按照以下步骤进行：4℃、10min，-20℃、30min，-80℃、360min，转移至液氮中长期保存。