[发明专利]一种单细胞全基因组测序文库的构建方法

说明书

本发明提供一种单细胞基因组测序文库的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：所述的构建方法包括如下步骤：1)提供微腔室，所述微腔室包含单细胞的全基因组DNA；2)在所述微腔室内，加入携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂进行扩增，得到含有索引条形码的全基因组扩增产物；3)纯化，得到所述单细胞全基因组测序文库。本发明在单细胞全基因组扩增的过程中，引入细胞特异性条形码序列，在实现单细胞全基因组扩增的同时，给每个单细胞全基因组扩增产物标识上细胞特定的识别索引条形码，后续连接上接头进行三代测序，可以实现单倍型分辨率的复杂基因组组装和宏基因组的组装。

技术领域

本发明属于单细胞测序领域，特别是涉及一种单细胞全基因组测序文库的构建方法。

背景技术

自然界中，复杂的生物系统是由多种不同类型的细胞组成的，且生物系统的生物学功能依赖于单细胞之间的协同作用。传统的研究方法以细胞群体作为研究对象，虽然可以获得大量的基因组成或转录组数据，但是无法揭示造成这种复杂性的细胞异质性。而近些年来兴起的单细胞测序技术，通过基于高通量的测序方法，可在单细胞层次上分析单细胞的转录组、基因组以及蛋白质组的信息，分析细胞间的异质性，便于研究者认识并理解复杂生物系统，揭示生命的奥秘。

目前的单细胞测序技术仍然依赖于二代测序方法。以单细胞全基因组测序为例，首先需通过一定的技术，例如微流控技术、流式细胞分选或人工分选等技术，将细胞分离捕获在独立空间内；接着，在独立空间内，对单细胞进行裂解获取单细胞的基因组DNA，裂解方法可为超声波粉碎、酶裂解等；最后，根据二代测序文库建库流程，其中包括全基因组扩增、扩增产物索引化、扩增产物片段化、加上二代测序接头等步骤，构建出二代测序文库，再上机进行测序分析。然而，在二代测序为基于短读段的测序技术中，单个DNA分子必须扩增成相同的DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度，从而读出DNA序列，而随着读段增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，限制了二代测序的读段长度(不超过600bp)，因此，为保证测序质量，需对基因组进行片段化操作。此外，二代测序获得的读段通常较短，在进行未知物种基因组的从头拼接时，利用测序数据组装出的重叠群，由于读段尺寸太小，无法识别更大的基因组重复序列，因而阻碍了复杂基因组的组装和单倍型遗传基因信息的解析；在宏基因组中，由于测序复杂度高，序列覆盖率较低，测序所得短序列通常无法重叠，因而导致了宏基因组组装的困难，从而使得从微生物群落中索引全长基因和代谢途径困难重重。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单细胞全基因组测序文库的构建方法。

本发明第一方面提供一种单细胞全基因组测序文库的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：

1)提供微腔室，所述微腔室包含单细胞的全基因组DNA；

2)在所述微腔室内，加入携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂进行扩增，得到含有索引条形码的全基因组扩增产物；

3)纯化，得到所述单细胞全基因组测序文库。

优选的，所述携带有索引条形码的随机引物的长度为2～99个碱基。

优选的，所述携带有索引条形码的随机引物包含条形码序列和随机引物序列。

优选的，所述微腔室的体积大小为皮升至纳升。

优选的，所述微腔室选自微液滴、凝胶微球、半透膜体系、脂质体体系、微孔板或离心管。

更优选的，当微腔室为微液滴时，将携带有索引条形码的随机引物和扩增反应试剂加入于所述微液滴内。

进一步优选的，所述携带有索引条形码的随机引物通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。

进一步优选的，所述扩增试剂通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。