[发明专利]一种蛋白核小球藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用

说明书

本发明公开了一种蛋白核小球藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用。该突变株为蛋白核小球藻(Auxenochlorella pyrenoidosa)CX41和蛋白核小球藻(Auxenochlorella pyrenoidosa)MC8中的至少一株，均于2023年04月14日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为GDMCC No:63357和GDMCC No:63358。本发明中的突变株CX41和MC8的叶绿素a含量比野生型降低了98％以上，无叶绿素b，可用于生产蛋白和叶黄素，为发酵生产替代蛋白提供了高品质、高产能的优良藻种。

技术领域

本发明属于微生物工程领域，特别涉及一种蛋白核小球藻叶绿素合成缺陷型突变株及其应用。

背景技术

当前国际形势下，保障粮食安全是关系国民经济发展、社会稳定和国家自立的全局性重大战略问题，是建立自主可控、安全的产业链基础。树立“大食物观”概念，向植物、动物、微生物要热量、要蛋白，进一步聚焦新食品原料及新蛋白质和热量供给，为未来食品提供多元化发展路径。

目前，经济作物种植业和畜牧养殖业是食物蛋白质获取的主要途径，但存在环境污染严重、水土资源消耗大、温室气体排放加剧、涉及动物福利等问题，难以满足人类日益增长的蛋白需求和环境友好型发展方式的要求。在这一大背景下，大规模、低成本、可持续的蛋白质生产方式亟需创新和发展。

蛋白核小球藻是一类单细胞绿藻，蛋白含量高达50％～65％，富含多糖、多不饱和脂肪酸、维生素等多种生物活性物质，具有极高的营养价值，被联合国世界粮农组织推荐为“二十一世纪最理想食品”。蛋白核小球藻可在人工开放系统或封闭系统中进行光合自养商业化生产，也可在工业发酵系统中实现快速高密度发酵，尤其是发酵法生产潜力巨大，被视作替代蛋白发酵生产的优质微生物种质。

然而，由于野生型小球藻具有刺鼻的藻腥味且呈深墨绿色，导致其食品气味和感官不佳，成为其作为替代蛋白和食品配料市场应用的最大限制。为解决颜色和气味干扰，食品级绿藻藻粉的叶绿素脱除加工这一步骤必不可少。单细胞绿藻常用的叶绿素脱除方法包括溶剂提取法和基因改造法。其中溶剂提取法，如超临界CO₂法、吸附树脂法和有机溶剂浸提法等工艺复杂，叶绿素和腥味物质的脱除不完全，且会造成高成本、环境污染和营养成分损失。而基因操作、诱变等手段可以实现从根本上抑制或阻断细胞内叶绿素的生物合成途径，在遗传物质水平上突破藻株性状表达上的瓶颈，可能是更为有效的途径。

常压室温等离子体(atmospheric pressure room temperature plasma，ARTP)诱变是一种新型的物理诱变育种技术，操作简易、射流温度低、活性粒子分布均匀、正向突变率高、对人体和环境无危害，主要应用于真菌、细菌育种，可为选育目的菌株提供创新平台方法，是降低或消除单细胞绿藻中叶绿素合成与腥味物质形成的新途径。

然而，人工诱变后会产生大量突变株，突变株的精准快速筛选是获得优良目标藻株的关键环节。目前传统筛选方法多用摇瓶、平板或试管体系进行培养检测，多为劳动密集型、操作繁琐费时、平行度差且效率低下，阻碍了生物诱变育种的进一步发展。因此，建立有效的筛选模型是进行菌种高效筛选的必要条件。其中目标产物合成抑制剂作为定向筛选剂，是筛选高产目标产物菌株常见的手段。通过添加合适剂量的抑制剂，使得一般突变株无法正常合成目标产物甚至死亡，而目标突变株则仍能部分合成目标产物，去除抑制剂后，其目标产物含量往往高于一般突变株。因此，通过选择合适的致死率，可以大幅度提高筛选效率。此外，高通量筛选技术是一种通量大、特异性高、适用于单细胞微生物的筛选技术。国产全自动高通量微生物液滴培养仪(Microbiol Microdrop Culture system,MMC)成功实现了微生物微液滴培养技术装备化，可同时对200个独立的微生物液滴进行微流控系统中的培养，集高通量培养和高精度分选为一体，可进行自动传代、化学因子梯度添加、液滴在线吸光强度和荧光发射强度检测等，大幅度提高了筛选效率和精度。

发明内容