[发明专利]用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用。本发明首先公开了用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物V600M‑F和V600E‑F、SEQ ID NO.3所示的反向引物V600R和SEQ ID NO.4所示的检测探针V600P。进一步公开了包含上述引物探针组合物的试剂盒及其应用。利用本发明引物探针组合物对待测样本进行检测，灵敏度和特异性高，同时检测多种BRAF V600基因突变，可根据扩增曲线直接判断有无突变，无需计算ΔCt，简单直接。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

BRAF基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在肿瘤患者中最常见的突变是第15号外显子上的V600E突变，BRAF V600K、V600R、V600D和V600M约占有10～20％。BRAF V600E突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。NCCN指南推荐的Lynch综合征的检测策略中，推荐在DNA错配修复蛋白缺失的病例中进行BRAF基因突变检测。BRAF是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，BRAF V600E突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，Ⅱ期临床试验证明携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，BRAF基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。现有的BRAF V600基因突变检测技术主要包括qPCR、ARMS、ddPCR、NGS等。ddPCR和NGS虽然能在临床上提供较好的价值，但因需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。现在市面上针对BRAF V600突变检测的主要产品为ARMS-PCR，目前存在以下几个缺点：(1)对于单点突变检测需在引物3’端引入额外突变或者进行引物自我配对形成颈环结构，导致灵敏度降低，对于临床上肿瘤患者穿刺组织经常出现肿瘤细胞过少的情况，而对此类样本点突变的检测则要求更高灵敏度的技术避免试剂敏感性问题造成假阴性风险；(2)特异性较低，不能完全抑制野生型样本的扩增，结果判读需计算ΔCt较复杂，不能满足临床要求。(3)只能检测BRAF V600E基因突变，虽然p.V600E突变是BRAF基因中最常见的突变，占所有V600密码子突变的80～90％，但其他不太常见的V600密码子突变包括：c.1798_1799delGTinsAA，p.V600K(5～12％)、c.17981799delGTinsAG，p.V600R(～5％)、c.1799_1800delTGinsAT，p.V600D(～1％)、c.1798GA，p.V600M(1％)也占有10～20％，容易造成漏检。

因此，需要开发出一种新的用于检测BRAF V600基因突变的AMRS-PCR检测体系，以解决上述问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供敏感性高、特异性好的用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物。

本发明的另一个目的在于提供包含上述引物探针组合物的用于检测BRAF V600突变的试剂盒及其应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明首先提供了一种用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物V600M-F和V600E-F、如SEQ ID NO.3所示的反向引物V600R和如SEQ ID NO.4所示的检测探针V600P。

进一步，所述检测探针V600P的5’端标记荧光基团，所述荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，3’端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ1中一种。