[发明专利]用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测BRAF V600基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物V600M-F和V600E-F、如SEQ IDNO.3所示的反向引物V600R和如SEQ ID NO.4所示的检测探针V600P。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物还包括如SEQ ID NO.5所示的正向内标引物GF、如SEQ ID NO.6所示的反向内标引物GR和如SEQ IDNO.7所示的内标探针GP。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述检测探针V600P的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；

所述内标探针GP的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；

其中，所述荧光基团选自FAM、JOE、HEX、VIC、CY5、TET中一种，所述淬灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ1中一种。

4.权利要求1-3任一所述的引物探针组合物在制备用于检测BRAF V600基因突变的试剂或试剂盒中的应用。

5.一种用于检测BRAF V600基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的引物探针组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括完成AMRS-PCR反应所需的其他试剂；优选的，所述试剂盒包括ARMS专用Taq酶，荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，阴性对照，阳性对照中的部分或全部；更优选的，所述ARMS专用Taq酶为SNUPP Taq DNApolymerase；更优选的，所述阴性对照为无核酸水和/或293T细胞gDNA，所述阳性对照为包含BRAF V600基因突变的重组质粒。

7.一种检测BRAF V600基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)获取待测样本的基因组DNA；

(2)以基因组DNA或阴性对照或阳性对照为模板利用权利要求1-3任一所述的引物探针组合物或权利要求5或6所述的试剂盒构建PCR扩增反应体系进行荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号观察扩增曲线；

(3)结果分析：

①阳性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照具有明显的扩增曲线，检测待测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明待测样本存在BRAF V600基因突变；

②阴性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照具有明显的扩增曲线，检测待测样本无Ct值且曲线无明显的指数增长期，说明待测样本不存在BRAF V600基因突变或待测样本突变率低于最低检测限。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系的总体积为50ul，包括：5×SNUPP Taq Buffer 10ul，浓度10uM的V600M-F 1ul，浓度10uM的V600E-F 1ul，浓度10uM的V600R 0.5ul，浓度2uM的GF 1ul，浓度2uM的GR 1ul，浓度2uM的GP 0.5ul，浓度5U/μL的SNUPP Taq DNA polymerase 1ul，基因组DNA或阴性对照或阳性对照10-50ng，余量的ddH₂O。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，64℃退火25s，68℃延伸25s，循环10次；95℃变性15s，60℃退火20s，68℃延伸20s，循环35次。

10.根据权利要求1-3任一所述的引物探针组合物或权利要求4所述的应用或权利要求5或6所述的试剂盒或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述BRAF V600基因突变包括BRAF V600E1、V600E2、V600K、V600R、V600D 1、V600D2和V600M基因突变中一种或多种。