[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法

说明书

本发明属于生化领域，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。通过截取自某一野生毒株的GP5蛋白的核苷酸序列的一部分，并对截取得到的核苷酸序列进行碱基优化的实验，最终得到了一种GP5蛋白，该蛋白能够大量表达，具有较好的抗原性，在应用于试剂盒后对猪繁殖与呼吸综合征具有较优的特异性、敏感性、重复性、相关性；同时，本发明还公开了该蛋白的制备方法和用途、与该蛋白对应的基因优化位点、采用该蛋白的试剂盒和检测方法。

技术领域

本发明涉及生化领域，具体为一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白及其制备方法和用途、基因、试剂盒和检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪（特别是仔猪）呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。针对PRRSV，现有的疫苗（如灭活疫苗、弱毒疫苗等等）可以起到一定保护作用，但临床中PRRSV疫苗的滥用导致出现免疫失败。如何评价灭活疫苗和其他疫苗的免疫效果，对猪群抗体水平进行系统评价，从而合理有序地进行疫苗免疫，这对猪群的疫苗免疫具有重要参考价值。

PRRSV为单股正链的RNA病毒，因此在进化过程中不断发生变异，继而重组以及出现新的毒株，而目前有很多种手段检测PRRSV，包括RT-PCR、荧光定量PCR、ELISA、IFA、IPMA等等。其中ELISA方法容易操作、特异性好，能检测大批量的样品，有利于对猪群PRRSV流行病学的监测和防控，是常用的血清学抗体检测方法。目前，市场上大部分的商业ELISA试剂盒使用N蛋白进行诊断，一方面是N蛋白为PRRSV抗原性最强的蛋白，可以实现早期诊断；另一方面是N蛋白为I型和Ⅱ型PRRSV的共享表位，使基于N蛋白的ELISA可以通用于两种病毒的检测。但N蛋白抗体跟保护性没有直接关系，因为它们没有病毒中和能力，无法用来评估疫苗免疫效果。而GP5蛋白又称为E蛋白，是PRRSV最重要的结构蛋白之一，且有研究表明GP5蛋白刺激机体产生抗体的中和能力明显强于M蛋白，所以临床上以选以检测GP5蛋白的抗体居多。因此，研制PRRSV血清抗体检测试剂盒的临床需求日益迫切，而检测PRRSV特异性GP5抗体水平为诊断该疾病提供了新的方法。

目前，市场上以N蛋白的IDEXX抗体检测试剂盒和检测GP5中和抗体的海博莱美洲型抗体间接试剂盒，但由于依赖国外进口，成本价格较高，采购周期较长的问题，不能快速、有效评价用于猪群自然感染病毒或接种疫苗后的免疫保护水平。

《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定》，动物医学进展，2016,37；记载如下内容：

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体，首先构建猪GP5基因的真核重组表达载体pCDNA GP5，将其作为免疫原，对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫４次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建GP5基因的原核重组表达载体pGEX6P GP5，将其转化至大肠埃希菌Rosetta（DE3）并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原，通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA GP5，表达并纯化了GP5蛋白。经2-3次亚克隆后获得３株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株，IFA和Westernblot对３株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制，为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。

该方案直接在毒株上通过引物扩增出蛋白核苷酸序列，并进行重组。

经过验证，如果不对原始GP5蛋白的核苷酸序列进行改造，将其制备成试剂盒，在特异性、敏感性等方面将有劣势。

所以，本案解决的技术问题是：如何通过新开发GP5蛋白以提高试剂盒的检测精度、特异性、敏感性等性能。