[发明专利]一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用，该融合葡萄糖氧化酶包括原料组分野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链。该制备方法包括制备由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成的融合葡萄糖氧化酶和由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成的融合葡萄糖氧化酶。该应用包括所述融合葡萄糖氧化酶在电化学传感器方面的应用。本发明制备方法简单易行，便于大量制备所述融合葡萄糖氧化酶，具有很好的应用前景，所形成的融合葡萄糖氧化酶具有较高的电子传递效率，所制作的电化学传感器具有较高的灵敏度和较快的响应速度，更适用于制作电化学传感器。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶是一种黄素蛋白(flavoprotein)，以分子氧为电子受体将β-D-葡萄糖催化反应成葡萄糖酸内酯与过氧化氢。在该催化反应过程中包括还原反应与氧化反应。在还原反应中，葡萄糖氧化酶将β-D-葡萄糖还原成葡萄糖酸内酯，其中葡萄糖酸内酯能够在非酶促反应下转化成葡萄糖酸，随后葡萄糖氧化酶中的辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)被还原成还原态的葡萄糖氧化酶-FADH2。在氧化反应中，还原态的葡萄糖氧化酶-FADH2通过与分子氧反应被重新氧化成葡萄糖氧化酶-FAD，并生成过氧化氢。且葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖具有严格的底物专一性，而对其他糖化合物仅具有较弱的催化能力。β-D-葡萄糖的C-1位在分子氧的存在下被氧化成1,5-葡萄糖内酯，随后自发水解为D-葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶的主要作用是制成生物传感器，属于糖尿病临床检测中的主要工具之一。

血糖传感器是以葡萄糖氧化酶为主要工作酶，通过电极监测葡萄糖氧化酶蛋白上电子的变化情况来计算血样中的葡萄糖水平，也有研究报道对血糖传感器进行了改良，可以通过荧光检测葡萄糖氧化酶结构内FAD的变化来进行测算葡萄糖浓度。除了用于制作便携血糖检测器外，葡萄糖氧化酶还能作为生物传感器被应用于其他方面，如作为光纤生物传感器用于分析饮料中葡萄糖的浓度，还可以应用于在血清检测仪中。

葡萄糖氧化酶作为酶电化学传感器的一种主要酶，其与电极间存在电子传递，具体的，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，被氧化成葡萄糖酸(Glucola ctone)，铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾，即三价铁(Fe³⁺)得到一个电子变成二价铁(Fe²⁺)；葡萄糖氧化酶变成还原态，然后又催化Fe²⁺氧化成Fe³⁺，即亚铁氰化钾被氧化成铁氰化钾，同时释放出一个电子，该反应在恒电位的作用下即可形成电流，通过检测电流变化可以算出酶制作的电化学传感器灵敏度。大多数天然酶的氧化还原中心被深埋在分子内部，氧化还原中心的外围有一绝缘的包围圈。这层包围圈可以避免电子的随意流动节约能量，但是用此类天然酶来制作电化学传感器时，使得酶与电极间很难直接进行电子传递。

发明内容

本发明目的在于提供一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用，具体技术方案如下：

在第一方面，本发明提供了一种融合葡萄糖氧化酶，包括以下原料组分：野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链；所述野生型葡萄糖氧化酶为黑曲霉A.niger BBE11721的葡萄糖氧化酶，其基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述碱性氨基酸侧链包括精氨酸和组氨酸中的任意一种。

可选的，所述融合葡萄糖氧化酶由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成。

可选的，所述融合葡萄糖氧化酶由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成。

在第二方面，本发明提供了一种制备所述融合葡萄糖氧化酶的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5’端加入酶切位点SnaBI序列，在3’端键入NotI序列；