[发明专利]一种融合葡萄糖氧化酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，包括以下原料组分：野生型葡萄糖氧化酶和碱性氨基酸侧链；所述野生型葡萄糖氧化酶为黑曲霉A.nigerBBE11721的葡萄糖氧化酶，其基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述碱性氨基酸侧链包括精氨酸和组氨酸中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接组氨酸构成。

3.根据权利要求1所述的融合葡萄糖氧化酶，其特征在于，由所述野生型葡萄糖氧化酶通过连接肽连接精氨酸构成。

4.一种制备如根据权利要求2所述的融合葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5’端加入酶切位点SnaBI序列，在3’端键入NotI序列；

步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；

步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；

步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与组氨酸组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有无缝克隆所需的同源臂；将步骤S3获得的所述目标产物采用SacI酶线性化后；采用无缝克隆试剂盒对SacI酶线性化后的目标产物和扩增后的寡聚核苷酸序列分别进行无缝克隆；对无缝克隆完成的产物进行测序；

步骤S5：将测序后的产物转化至GS115菌液中，将所述菌液涂布于MD平板，并于30℃条件下恒温培养3-5天，观察菌落生长情况，挑选生长良好的菌落，做菌落PCR鉴定，将阳性菌保种，获得融合葡萄糖氧化酶。

5.一种制备如根据权利要求3所述的融合葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：将所述野生型葡萄糖氧化酶碱基序列进行基因合成，并在野生型葡萄糖氧化酶碱基序列的5’端加入酶切位点SnaBI序列，在3’端键入NotI序列；

步骤S2：首先，将质粒载体pPIC9K及由步骤S1合成后的野生型葡萄糖氧化酶碱基序列均采用SnaBI和NotI双酶切，回收切开后的野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段和目标质粒片段，并分别测定野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段的质量浓度和目标质粒片段的质量浓度；其次，将野生型葡萄糖氧化酶目标基因片段与目标质粒片段按照质量比3：1配置20ul；然后，加入连接酶，并于16℃水浴连接过夜，获得连接产物；

步骤S3：将所述连接产物转化至大肠杆菌细胞中，采用氨苄青霉素筛选阳性克隆并测序，测序同SEQ ID NO.1的菌种扩大培养并提取目标产物保存；

步骤S4：将寡聚核苷酸序列进行基因合成，所述寡聚核苷酸序列是由连接肽与精氨酸组合的序列；使用引物对合成后的寡聚核苷酸序列进行PCR扩增，使其具有无缝克隆所需的同源臂；将步骤S3获得的所述目标产物采用SacI酶线性化后；采用无缝克隆试剂盒对SacI酶线性化后的目标产物和扩增后的寡聚核苷酸序列分别进行无缝克隆；对无缝克隆完成的产物进行测序；

步骤S5：将测序后的产物转化至GS115菌液中，将所述菌液涂布于MD平板，并于30℃条件下恒温培养3-5天，观察菌落生长情况，挑选生长良好的菌落，做菌落PCR鉴定，将阳性菌保种，获得融合葡萄糖氧化酶。